1 Отдел за невробиология и неврофизиология за развитие, Институт по невробиология, Университет на националния автоном на Мексика, Campus UNAM Juriquilla, Boulevard Juriquilla # 3001, Керетаро, QRO, c.p. 76230, Мексико

съставът

Резюме

1. Въведение

В зависимост от здравословното състояние, същите диети влияят различно на метаболитните показатели на организма, оцеляването и благосъстоянието [1] и трябва да се направи много, за да се получат постоянни резултати [2]. Хетерогенните експериментални условия и разликите на субектите водят само до общи заключения [3]. Освен това малко се знае за дългосрочните ефекти на диети с различен състав с една и съща калорична стойност, особено в диабетичните състояния в сравнение с контролните сигнали за инсулин, през по-голямата част или целия жизнен цикъл.

Общите проблеми, присъщи на повечето проучвания, са трудностите при хомогенизирането на генетичния произход, спазването на строгите диетични режими в дългосрочен план и хомогенността на страдащите от диабет [4]. Захарният диабет е сложно заболяване при хората. Характеризира се с променени нива на глюкоза в кръвта, разделени на два основни типа: захарен диабет тип I, поради дефицит в производството на инсулин и захарен диабет тип II, поради резистентност към инсулиновото действие в организма. Докато тип I обикновено е автоимунно заболяване, което е насочено и убива клетките, произвеждащи инсулин при пациенти (бета клетки на островчета Лангерханс в панкреаса), тип II е полигенен и силно повлиян от диетата и околната среда. Има и редки моногенни случаи, наречени съвместно MODY (Диабет при зрелост при млади), които споделят характеристики и на двата типа, но които обикновено са причинени от дефекти в развитието на панкреатичните островни клетки и секрецията на инсулин, по-сходни със захарен диабет тип I и обикновено причинени чрез доминиращи мутации [5].

Няколко проучвания демонстрират нарастващ брой гени и конкретни алели, които влияят на склонността към развитие на захарен диабет тип II при хората [6], като резултатите от замъгляването са направени при използване на хора с различен генетичен произход, което прави сравненията между проучванията трудни. Същото важи и за повечето модели на диабетни животни, при които генетичната хомогенност не се прилага стриктно [7].

Също така, стриктното спазване на определен диетичен режим е почти невъзможно в дългосрочен план с експериментални субекти като хората. Популярните животински модели, като гризачи, обикновено са „направени“ диабетици (напр. Чрез лечение със стрептозотоцин), а не „родени“ диабетици, така че объркващ въпрос е развитието на състоянието на диабет в различна степен и темпо, дори ако същият хранителен режим се прилага през цялото време.

Различните степени на засягане или тежестта на диабетичното състояние също могат да отклонят резултатите от дългосрочните проучвания, дори ако всичко останало се поддържа постоянно. Тук се опитахме да преодолеем тези често срещани подводни камъни чрез използване на хомогенни, генетично дефинирани мутантни хипоморфни условия на инсулиновия сигнален път за моделиране на диабет тип II (инсулинова резистентност) заедно с контролен щам [8], където всички запаси имат еднакъв генетично хомогенизиран фон.

От първоначалното характеризиране на първия жизнеспособен мутант в Дрозофила инсулинов път преди повече от двадесет години [9], плодовата муха се е превърнала в предпочитан организъм за изследвания на инсулин [7]. Инсулиновият път при мухите е еволюционно запазен и е широко характеризиран [7, 10].

Ние моделирахме различна степен на диабетна афектация, използвайки мутации в три различни генетични локуса, на различни нива в инсулиновата сигнална каскада. Ние култивирахме мухите в изокалорични диети, с различен процент на протеини спрямо липиди/въглехидрати, и във всеки случай с два варианта: снабдени или не с допълнителен метионин, като заедно използваме осем различни диетични режима. Доказано е, че диетичните нива на метионин влияят върху продължителността на живота при гризачи и мухи с някои противоречиви резултати [11-16]. Поради това се опитахме да проучим дали промените в съдържанието на метионин в диетите на мухите значително ще променят параметрите, измерени в нашите експерименти, и биха променили значително състоянието на диабет, особено продължителността на живота, което не е било изследвано преди.

2. Материали и методи

2.1. Дрозофила Запаси

Следните мутантни алели на инсулиновия рецептор (Inr), каталитична субединица на фосфатидилинозитол 3 ’киназа (Pi3K92E) и S6 киназа (S6k) в тези проучвания са използвани гени: Inr E19 (химически индуцирана мутация, която не се намира в кодиращата последователност), и

; Pi3K92E A (изтриване на кодираща последователност в 3 ’края) и

(Pi3K92E е известен още като Dp110, и ще го наречем Dp110 в хартията);

(изтриване в 5 ’от кодиращата последователност) и S6k 07084 (вмъкване на транспозон на Р елемент в промоторната област; S6k 07084 е известен още като S6k Р1713; ще използваме това име в статията), всички първоначално получени от E. Hafen, ETH, Швейцария, описани във FlyBase [17]. Всички алени-мутанти са били кръстосани между пет и десет поколения на контрола жълт, бял (у, w, призова в тази статия yw) запас преди употреба, за да хомогенизира генетичния произход. Това yw първоначално самият изогенизиран, както по-горе, се използва за изогенизиране на мутантните запаси и се използва като контролен запас от див тип. Версия на третата хромозомна балансираща хромозома, TM3, също описана във FlyBase [17], носеща трансген, експресиращ зеления флуоресцентен протеин (GFP) от актиновия 5С усилвател (Бломингтън, запас номер 4534), беше използвана за балансиране на всички мутантни алели. Тази хромозома на балансьора също беше пресечена на yw фон, както по-горе, за хомогенизиране на генетичния фон. Споделянето на генетичен произход позволява директни сравнения между всички запаси и избягва използването на хетерозиготни братя и сестри, които могат или не могат да споделят един и същ генетичен произход.

2.2. Генетика

Във всички случаи хомозиготните мутанти са летални, затова използвахме жизнеспособните хетероалелни мутантни комбинации: Inr E19 /, Pi3K92E A /, и / S6kp 1713. Използвахме и контрол yw мухи, развъждани успоредно с запасите от мутанти, които се бяха затворили едновременно с хетероалелните комбинирани мутанти. Тъй като тези три локуса действат на различни нива в инсулиновия път, те са различни модели на диабет тип II. Често срещаните фенотипове между различните жизнеспособни хетероалелни комбинации показват общите изисквания за инсулиновия път (тези мухи имат всички отличителни черти на инсулиновите пътища с компрометирани мухи: Те са значително по-малки и по-малко ларви достигат до състоянието на кученцето; например, вижте допълнителна таблица 1), докато специфичните фенотиповете или силата, проявена от общ фенотип, може да са германни за локуса или нивото на въпросната хипоморфия.

Кръстове бяха направени между хетерозиготни мухи, носещи различни алели от един и същ ген. Прясно излюпените ларви от първа възраст бяха събрани, преброени, разделени на групи от сто или сто петдесет, според генотипа (хетероалелни мутантни ларви бяха отделени от хетерозиготни братя и сестри, носещи GFP-експресираща балансираща хромозома), и прехвърлени в хранителни флакони с различните диети. Ларвите се развиват в различните диети и броят на случаите на кученца е преброен (допълнителна таблица 1). Прясно затворени възрастни са използвани за експерименти.

2.3. Диети
2.4. Изследвания за оцеляване

Новоизлюпените ларви от първа възраст на различните изследвани генотипове бяха избрани и поставени в стъклени флакони с различен хранителен режим и оставени да се какавидират и да се затворят. Еднодневни девствени жени от различните генотипове бяха поставени в групи от по десет на флакон с различните диети. Всеки флакон съдържа 5 grs от конкретната тествана диета. Оцеляването се изследва на всеки три дни и оцелелите мухи се прехвърлят във флакони с прясна храна на всеки седем до десет дни по време на експеримента. Флаконите се култивират при 25 ° C и 40-50% относителна влажност, в цикъл 12:12 светлина: тъмно през целия експеримент.

2.5. Общо измерване на въглехидрати, общ липид и тегло

Общите измервания на въглехидрати и липиди бяха оценени при 7-10 отделни мухи, следвайки протоколите на Van Handel [19], както е приложено в [9]. Девствените женски мухи са използвани по време на анализа на възраст от един и пет дни, култивирани при различни диети. Същите мухи, преди да бъдат обработени за измерване на общите въглехидрати или липиди, бяха претеглени индивидуално с помощта на микровес Cahn C-31, зададен в 0.1 μg - диапазон от 25 mg, както е съобщено в [20].

2.6. Статистика

Използвахме двупосочна ANOVA с post-hoc тестове на Фридман за анализ на продължителността на живота. За ефектите от диетите върху теглото, общите въглехидрати и липиди и ефектите между едно- и петдневни мухи, използвахме ANOVA с post-hoc тестове на Sidak. Всички тестове бяха направени, както са приложени в Prisma, в GraphPad.

3. Резултати

3.1. Диетичните режими влияят върху теглото (размера) на възрастните мухи

За всички експерименти събрахме възрастни мухи, отгледани от излюпване на ларви на първа възраст до възрастни в различните диети. На Фигура 1 показваме пример за контролната и хетероалелна (мутантна) комбинация, използвани в проучванията (Фигура 1). За да определим количествено размера, претеглихме отделните мухи в микровес на същата възраст. В почти всички случаи мутантните генотипове са със значително по-малко тегло от съответния контрол (yw) мухи. Тъй като всички мухи имат еднакъв генетичен произход, можем директно да сравним резултатите от различните генотипове.