Резюме

  • VGF
  • невротрофин
  • хипоталамус
  • затлъстяване
  • агути
  • POMC
  • NPY
  • лептин
  • меланокортин

Хипоталамусните нервни пътища в ЦНС регулират храненето и разхода на енергия. Състоянието на периферните мастни запаси се предава на мозъка чрез циркулиращи хормони като лептин, синтезиран от адипоцити протеин, който трансдуцира сигнала си чрез транспорт и свързване към рецепторната система на лептина в хипоталамуса (Ahima et al., 2000; Schwartz et al. ., 2000). Тук пътищата на меланокортин, индуциращи ситост, намаляват приема на храна чрез взаимодействието на два пептида, които се конкурират за свързване с рецептора на меланокортин 4 (MC4-R), стимулиращия α-меланоцит хормон (α-MSH) и неговия антагонист, свързан с аготи полипептид (AGRP) ). Ефектите на тези реагиращи на лептин вериги върху енергийния баланс се медиират от проекции в рамките на хипоталамуса върху мозъчния ствол, гръбначния мозък и мозъчната кора и в крайна сметка върху автономните пътища, които инервират периферните метаболитни тъкани (Ahima et al., 2000).

златна

Анализите на няколко модела на затлъстели мишки показват, че лептинът и пътят на меланокортина играят критична роля в регулирането на енергийния баланс. Мишки с мутации в гените на лептин (ob/ob) или рецептор за лептин (db/db) развиват затлъстяване в началото, което е свързано с намалена скорост на метаболизма, увеличен прием на храна, диабет и намалена плодовитост (Friedman and Halaas, 1998). Мишки с дефектна сигнализация в меланокортиновия път, причинена от целенасочена делеция на хипоталамусния MC4-R или неговия агонист α-MSH [про-опиомеланокортин (POMC) нокаут] или чрез свръхекспресия на антагонистите на меланокортиновите рецептори (A y/a ) или свързаният с агути протеин [AGRP или свързан с агюти транскрипт (ART)], развиват синдром на затлъстяване в зряла възраст, свързан с хиперфагия, хиперинсулинемия и хипергликемия (Barsh, 1999; Salton et al., 2000a). Инбридинг на тези затлъстели мишки с други щамове, които съдържат допълнителни генетични мутации, като махагон (Gunn et al., 1999; Nagle et al., 1999) или избиване на невропептида Y (NPY) (Erickson et al., 1996) и анализът на фенотипите на полученото потомство е изключително полезна техника за по-добро определяне на молекулярните компоненти на лептиновия и меланокортиновия път.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Използвани щамове на мишката. Целевата делеция на гена на мишката Vgf и първоначалното характеризиране на VGF мутантни мишки е описана по-рано (Hahm et al., 1999). Химерните нокаутирани мъже от VGF бяха директно кръстосани до 129/SvJ или повторно кръстосани до щамове C57BL/6 в продължение на 10 поколения; хомозиготни VGF-дефицитни потомци на F10 и F1 хетерозиготи и на двата фона са фенотипно неразличими. За описаните тук експерименти се използват смесени фонови VGF мутантни мишки от поколения F2 и F3. За генериране на двойно-мутантни мишки са използвани плодородни хетерозиготни Vgf +/Vgf-женски мишки или двустранно овариектомизирани женски C57BL/6 × 129/SvJ (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), които са били присадени с яйчници Vgf−/Vgf−. Те са били чифтосвани с мъже A/a (agouti) или с плодородни мъже ob-/ ob-мъже, и двете на фона C57BL/6 (получени от лабораторията Джаксън), които са били спасени чрез курс на интраперитонеален лептин. Рекомбинантен миши лептин (20 μg/gm телесно тегло), щедро предоставен от Amgen Inc. (Thousand Oaks, CA), се доставя на ob-/ob-мъже два пъти дневно в продължение на 7 d и след това приблизително през ден в продължение на 30–60 d.

Проучване на гладно и заместване на лептин. Мишките от див тип и db/db бяха на глад 48 часа и бяха убити (група на гладно). За проучването за заместване на лептин мишките, хранени ad libitum и на гладно, се инжектират интраперитонеално на всеки 12 часа с физиологичен разтвор или лептин (0,5 μg рекомбинантен миши лептин/gm телесно тегло; R&D Systems, Minneapolis, MN). Последното, пето инжектиране се прилага 30 минути преди мишките да бъдат убити, 2 часа след включване на светлините.

Химически лезии. На мишки на възраст 3–4 месеца беше приложена еднократна интраперитонеална инжекция на златна тиоглюкоза (GTG) (0,8 mg/gm телесно тегло) (Bergen et al., 1998), след което мишките бяха претегляни на редовни интервали и приемът на храна беше измерена. Две седмици след инжектиране на GTG (или физиологичен разтвор), мишките бяха убити и тъканите бяха отстранени за анализ. Отделни групи диви и VGF мутантни мишки бяха убити 3 d след инжектиране на GTG, а мозъците бяха отстранени и изследвани хистологично чрез оцветяване по Nissl (Hahm et al., 1999), за да се потвърди, че хипоталамусните лезии са се развили при мишки от всеки генотип.

Инжекциите с мононатриев глутамат (MSG) се извършват чрез незначителна модификация на предишни методи (Pizzi and Barnhart, 1976). Мишките са получавали следните ежедневни подкожни инжекции, започвайки от постнаталния ден 2 (P2) до P12: 2,5, 2,8, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6 и 4,8 mg MSG на грам телесно тегло (в PBS ). Мишките се претеглят ежеседмично и се убиват на 9-месечна възраст, изолират се хипоталамусните РНК и се определя теглото на органите и тъканите.

Анализи на Northern blot, кръв и серум. Анализът на Northern blot се извършва, както е описано по-рано (Mizuno et al., 1996b), като се използват сонди за NPY (Mizuno et al., 1996a), POMC (Mizuno et al., 1998) и AGRP (Mizuno and Mobbs, 1999); относителните нива на иРНК бяха определени чрез денситометричен анализ на авторадиограмите на филма.

Мишките бяха анестезирани с авертин и кръвните проби бяха събрани чрез сърдечна пункция. Нивата на кръвната глюкоза се определят с помощта на профил с едно докосване (Lifescan Inc., Milpitas, CA). Нивата на серумен инсулин и лептин се определят чрез радиоимуноанализ (ICN Biomedicals, Inc., Коста Меса, Калифорния) или ELISA (Crystal Chem Inc., Чикаго, Илинойс).

Анализи на енергийния баланс и състава на тялото. Консумацията на храна се измерва ежедневно, като се използва или течна диета, или претегляща се система за доставяне на твърди пелети (Bio-Serv, Frenchtown, NJ) в продължение на 5 последователни дни и се осреднява. За диетични проучвания с високо съдържание на мазнини, мишките са били хранени в продължение на 5 седмици със стандартна чау или висококалорична чау (5,396 kcal/gm) с високо съдържание на мазнини (35,5%) и високо съдържание на въглехидрати (35,4%) (# F2685; Bio- Serv). Анализът на трупа на тялото за общ липид, протеин и вода беше извършен, както е описано по-рано (Chung et al., 1998; Hahm et al., 1999).

Всички третирани с колхицин животни бяха дълбоко анестезирани с натриев пентобарбитал и перфузирани транскардално с 20 ml 0,01 m PBS, pH 7,4, съдържащи 15 000 U/l хепарин сулфат, 150 ml 2% параформалдехид/4% акролеин в 0,01 m фосфатен буфер (PB ), рН 7,4, последвано от 30 ml 2% параформалдехид в същия буфер. Мозъците бяха отстранени и криозащитени в 30% захароза в PBS при 4 ° C за една нощ и след това замразени върху сух лед.

Имунофлуоресценцията се извършва по същество, както е описано по-рано (Fekete et al., 2000a). Коронарните срезове (с дебелина 25 μm) се инкубират в смеси от овчи анти-α-MSH (1: 5000) (Elias et al., 1998) или овчи анти-NPY антисерум (1: 1000) (Peninsula Laboratories, Belmont, CA) ) и заешки анти-VGF антисеруми (1: 400) (Salton et al., 1995), изплакнати в PBS, инкубирани в Тексас конюгирани магарешки анти-овчи IgG и FITC-конюгирани магарешки анти-заешки IgG (и 1:40; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) и анализирана от Zeiss (Thornwood, NY) Axioskop 2 епифлуоресцентна микроскопия.

Колокализация на VGF с α-MSH и NPY в дъгообразното ядро ​​на хранени и гладували плъхове. Микроснимките с малка мощност на двойно маркирани имунофлуоресцентни препарати (A – C) демонстрират колокализацията (жълто) на VGF (зелено) и α-MSH (червено) в ретрохиазматичния регион (A) и в ростралния (B) и каудалния ( В) част от дъгообразното ядро ​​на хранени с третирани с колхицин плъхове (n = 3). Микрографиите с ниска мощност (D, E) показват колокализацията на POMC иРНК (белязана с AMCA, псевдоцветно червено) и VGF иРНК (изображение на тъмно поле на сребърните зърна, псевдоцветно зелено) в дъгообразното ядро ​​на нахранения (D ) (п = 4) и гладни (Е) (п = 4) плъхове. При лекуваните с колхицин плъхове (F), VGF имунореактивността (зелено) и NPY имунореактивността (червено) са локализирани в различни популации на дъгообразни неврони. За разлика от това, 50% от NPY-имунореактивните неврони (жълти), локализирани дорзално, съдържат VGF в дъгообразното ядро ​​на плъхове, третирани с гладуващи колхицин (G) (n = 3).

NPY е мощен стимулатор на приема на храна, както и AGRP (или ART), антагонист на α-MSH, който се свързва с MC4-R, и тези два орексигенни пептида се експресират съвместно в хипоталамусните медиални дъгови неврони (Elias et al., 1998, 1999). Експресията на хипоталамусните NPY и AGRP иРНК се увеличава и POMC иРНК намалява с гладуване (Hahn et al., 1998; Mizuno et al., 1998, 1999). За да се изследва кои експресия на VGF на хипоталамусните неврони се регулира по време на гладуване, ние колокализирахме POMC и VGF иРНК и NPY и VGF полипептиди след лишаване от храна за 64 часа (Фиг. 1E, G). Отбелязахме значително намаляване на VGF сигнала в ретрохиазматичната област и страничното дъговидно ядро ​​в POMC-съдържащите неврони. Като цяло общата плътност на сребърните зърна в цялата дъгообразна (медиална и странична група) в резултат на хибридизация до VGF е по-малка при гладуващите животни, отколкото при хранените животни с ~ 50%. Наблюдавахме обаче и повишена хибридизация на VGF в медиалната част на дъгообразното ядро, което не се наблюдава при хранените животни. Използвайки двойно маркирана имунофлуоресценция, това увеличение се ограничава до произвеждащите NPY неврони и е дорзално спрямо NPY невроните, наблюдавани при хранените животни (фиг. 1G). В обобщение тогава, на гладно, експресията на VGF и NPY се индуцира в популация от медиални дъговидни неврони, но колокализацията на VGF и POMC намалява.

Индуцираното от гладуването повишаване на нивата на VGF иРНК в дъгообразното ядро ​​се инхибира от лептина