Редактиран от Дейвид Л. Денлингер, Държавният университет в Охайо, Колумб, Охайо, и одобрен на 4 септември 2009 г.

водата

↵ 2 W.W.J. и G.B.C. допринесе еднакво за тази работа. (получено за преглед на 17 юли 2009 г.)

Резюме

Диетичните ограничения (DR) са широко запазена интервенция, водеща до удължаване на продължителността на живота. Въпреки значителните усилия, механизмите, залегнали в основата на ДР, остават слабо разбрани. По-специално остава неясно дали DR удължава живота чрез запазени механизми при различни видове. Тук показваме, че в най-често срещаните експериментални условия удължаването на продължителността на живота от DR се премахва чрез осигуряване на Drosophila с вода ad libitum, без да се променя приема на храна, което показва, че DR, както обикновено се изследва при мухи, е коренно различен от феномена, изследван в бозайници. Ние характеризираме алтернативна диетична парадигма, която предизвиква стабилно удължаване на продължителността на живота, независимо от наличността на вода, и по този начин вероятно представлява по-подходящ модел за DR на бозайници. Нашите резултати подкрепят виждането, че съотношението протеин: въглехидрати е основният хранителен определящ фактор за продължителността на живота на мухата. Тези открития имат широко значение за изучаването на продължителността на живота и храненето.

Диетичните ограничения (DR), класически дефинирани като намаляване на наличността на хранителни вещества при недохранване, могат да удължат живота на организмите, вариращи от дрожди до мишки (1, 2). При гризачите и приматите DR забавя появата на свързани с възрастта патологии, като рак, сърдечно-съдови заболявания и диабет (3-5). Хроничният DR също предизвиква редица физиологични промени, включително намалени нива на циркулираща глюкоза, инсулин и холестерол; намалена телесна маса; и нарушена репродуктивна функция (5-8). Въпреки очевидния биомедицински интерес към DR, неговата механистична основа остава до голяма степен неизвестна и не е ясно дали DR удължава продължителността на живота при различни видове чрез подобни механизми (9, 10). Този въпрос е от основно значение, тъй като моделите на безгръбначни са особено ценени заради способността им да предоставят механистични улики, които да бъдат тествани при бозайници.

При бозайниците ограничението на храната се налага чрез хранене на кохортата DR с част от тази, погълната от групата ad libitum (2). Поради трудността да се контролира скоростта на хранене при безгръбначни, се използват по-гениални, макар и потенциално проблематични техники. Drosophila DR обикновено се постига чрез пълно разреждане на храната (11) и се извършва в отсъствието на отделен водоизточник, за разлика от други видове (12-16). Следователно храната за мухи е едновременно източник на хранителни вещества * и вода. Тази настройка предотвратява мухите да регулират независимо приема на хранителни вещества и вода, оставяйки място за възможността каквито и да е ефекти от разреждането на храната да бъдат медиирани от промени в хидратацията.

Нашите резултати показват, че удължаването на продължителността на живота от типичните режими на DR (17–20) може да бъде напълно премахнато, като се осигури на мухите свободен достъп до вода. Добавянето на вода не засяга консумацията на храна, което предполага, че DR, както обикновено се прилага, не влияе на дълголетието чрез намален прием на хранителни вещества. Освен това, ние характеризираме режим, който предизвиква стабилно удължаване на живота, независимо от добавянето на вода. Нашите открития показват, че по-голямата част от работата, извършена върху Drosophila DR, е объркана от промени в хидратацията. В условия, при които приемът на вода не е ограничителен, модулацията на продължителността на живота чрез DR може да се обясни със съотношението протеин: въглехидрати.

Резултати и дискусия

Приемът на храна и вода, изследван чрез средно радиомаркиране (22). (A и B) Хранени с екстракт от мая/захароза (YE/S) мъже Canton-S, поддържани в демографски клетки. (C и D) Мъжки Canton-S, хранени с бирена мая/захароза (BY/S), отглеждани в демографски клетки. (E и F) Дамски жени, хранени с BY/S, поддържани във флакони. Мухите пият по-големи количества вода и консумират по-малко от храната, тъй като концентрациите на YE/S (A и B) или BY/S (C – F) се увеличават. Резултатите се изразяват като средно (± SD) от 2–6 опити, всяко от които съдържа 6–16 мухи. Състав на храната, YE/S: DR = 2,5% YE + 2,5% S; CM = 10% ДА + 10% S; 2 × CM = 20% ДА + 20% S; BY/S: DR = 10% BY + 5% S; CM = 20% BY + 10% S (всички тегло/обем). Статистическата значимост беше определена чрез несдвоени двустранни t-тестове на Student между резултатите на DR и CM или CM и 2 × CM среда: *, P 0,05).

Колективно нашите резултати показват, че изправени пред обичайните източници на храна/вода, използвани в DR, мухите дават приоритет на регулирането на приема на хранителни вещества чрез компенсаторно хранене, за сметка на оптималната хидратация. Тъй като мухите, изложени на по-богати среди, са значително по-жадни от контролите (фиг. 1 A, C и E), попитахме дали това състояние на хронична дехидратация влияе на дълголетието. Продължителността на живота е измерена на DR и CM със и без добавяне на вода. В контролната група водната среда (1% агар) беше покрита с найлонова мрежа, предотвратяваща достъпа до водоизточника, като същевременно осигуряваше идентична влажност. Поразително е, че достъпът до вода ad libitum удължава оцеляването на мухите, хранени с CM, до нивото на техните кохорти DR, докато последните имат само лека полза в присъствието на вода (фиг. 2 А и Б). В резултат на това DR удължи живота в отсъствието, но не и в присъствието на водния източник (фиг. 2С и таблица S1). Неадитивният ефект на DR и добавките с вода върху продължителността на живота не се дължи на абсолютен „таван“ или максимум на продължителността на живота, тъй като други условия придават по-голяма дълголетие (Таблица S2).

Допълнителната добавка с вода премахва удължаването на продължителността на живота чрез диетични ограничения (DR). (A – C) Екстракт от дрожди/захароза (YE/S) - подхранвани от Canton-S мъже на възраст в демографски клетки. Криви на продължителността на живота без (A) и с (B) добавяне на вода на мухи, поддържани върху концентрирана (CM) или DR среда. (C) Средна продължителност на живота (± SEM) на мухи при диети на CM, DR или силно разредена среда за глад (SM), представляваща недохранване. (D – F) Криви на продължителността на живота и средната продължителност на живота, съответно в (A – C), на бирени дрожди/захароза (BY/S), хранени от Canton-S мъже на възраст в демографски клетки. (G – I) Криви на продължителността на живота и средната продължителност на живота, както в (A – C), съответно, на женски Dahomey, хранени с BY/S, на възраст във флакони. При липса на източник на вода диетата DR удължава живота в сравнение с мухи, хранени с CM при всички тествани условия (A, P = 1,3 × 10 −4; D, P = 2,4 × 10 −6, G, P = 2,5 × 10 -3; log-rank тест). (B, E и H) DR няма ефект (P> 0,05, log-rank тест) върху продължителността на живота при добавяне на вода. Съставът на храната е описан на фиг. 1; ДА/С: SM = 0,1% ДА + 0,1% S; BY/S: SM = 1% BY + 0,5% S (всички тегло/обем). n = 68–156 мухи на опит. Статистическите данни за анализа на пропорционалните опасности на Cox, демонстриращи силно намаления ефект на DR върху добавянето на вода, са показани в таблица S1.

Тествахме ефекта от достъпа до вода върху продължителността на живота при различни полове, щамове мухи, медии и заграждения за животни. Добавянето на вода имитира ефекта на DR за повишаване на дълголетието при всички тествани условия (фиг. 2 D – I и таблици S1 и S2), без съществен ефект върху приема на храна (фиг. 1 B, D и F). Степента на удължаване на продължителността на живота от DR при липса на вода е в съгласие с отчетените резултати (17). Забележително е, че един от нашите експерименти (Фиг. 2 G – I) точно възпроизвежда условията, предложени наскоро като най-подходящи за експерименти с DR, въз основа на техните ефекти върху продължителността на живота и плодовитостта (17). Най-простото обяснение на тези констатации е, че типичните условия, използвани в Drosophila DR и добавките за вода, удължават живота чрез до голяма степен припокриващи се механизми.

Нашите констатации противоречат на скорошно проучване, което не установи ефект върху продължителността на живота, когато водата се подава във върха на пипетата, въпреки че консумацията на вода не е потвърдена (17). Използваната тук значително по-голяма водна повърхност може да подобри ефектите на достъп или противодействие на тълпата, растежа на микроорганизмите, натрупването на екскременти или други неопределени фактори.

Въпреки че DR е установен върху екстракт от дрожди/захароза/царевично брашно (YE/S/C) само при различни дрожди (28, 29), тази парадигма се използва много по-рядко. За разлика от всички други тествани режими, YE/S/C предизвика пренебрежимо ниска консумация на вода както в неговите ниско-, така и в многодрождни форми (фиг. S2A), което показва, че YE/S/C е уникална по своята способност да задоволява животните нужди от вода. Интересното е, че намаляването на нивата на дрожди в YE/S/C стимулира поглъщането на храна (Фиг. S2B), демонстрирайки, че компенсаторното хранене не води непременно до дехидратация и предполагайки, че нуждите от вода се определят от взаимодействието между поведението на хранене и конкретния хранителен източник.

В парадигмата YE/S/C DR удължава продължителността на живота при мъжете и жените, независимо от достъпа до вода (Фиг. 3). Малкото увеличение на продължителността на живота на мъже, хранени с CM с достъп до вода, не е възпроизводимо (фиг. S3). Важно е, че плодовитостта на жените директно корелира с нивата на дрождите (фиг. 4), аргументирайки се срещу токсичния ефект на екстракта от дрожди (9). Следователно, ние сме установили парадигма, при която манипулацията с хранителни вещества има явно въздействие върху дълголетието, независимо от наличността на вода.

Добавянето на вода не влияе върху удължаването на продължителността на живота при намаляване на дрождите самостоятелно върху дрожден екстракт/захароза/царевично брашно (YE/S/C). (A – C) YE/S/C-хранени мъже от Canton-S на възраст в демографски клетки. Криви на продължителността на живота без (A) и с (B) добавяне на вода за мухи, поддържани върху концентрирана среда (CM) или диетични ограничения (DR). (C) Средна продължителност на живота (± SEM) на мухите на CM или DR. (D – F) Криви на продължителността на живота и средната продължителност на живота, съответно в (A – C), на жени, хранени с YE/S/C Canton-S, на възраст в демографски клетки. В тази парадигма, намаляването на продължителността на живота на дрождите както в отсъствието (A и D), така и в присъствието (B и E) на вода (P −6, log-rank тест). Състав на храната, YE/S/C: DR = 0,25% YE + 5% S + 8,6% C; CM = 5% YE + 5% S + 8,6% C (всички тегло/обем). n = 60–86 мухи на опит. Статистическите данни за анализа на пропорционалните опасности на Cox са показани в таблица S1.

Нашите констатации са в съответствие с виждането, че съотношението протеин: въглехидрати (P: C) е основният хранителен детерминант на дълголетието на мухата (34), факт, който може да е бил класически скрит от объркването на хидратацията. Както се предвижда от този модел, класическите парадигми на DR, базирани на разреждане на цялата среда и поддържащи по този начин постоянно съотношение P: C, имат само мек, независим от хранителните вещества ефект върху продължителността на живота, докато използваната тук YE/S/C парадигма, базирана на вариране на дрожди самостоятелно и по този начин промяна на съотношението P: C, влияе върху дълголетието по-драстично и по хранително-зависим начин. По-специално, нискодрождената форма на YE/S/C има съотношение P: C 1:15, подобно на 1:16, описано от Lee et al. като оптимална за дълголетие (34). Други парадигми на DR, които променят съотношението P: C в подходящия диапазон, без да причиняват дехидратация, трябва да бъдат функционално еквивалентни на YE/S/C. Нашите резултати също демонстрират забележителната пластичност на скоростта на хранене на дрозофила, в съгласие с констатацията, че продължителността на живота на мухата се определя от взаимодействието между съотношението P: C и приема на храна (34). Урокът, извлечен от тези наблюдения, е, че количествените измервания на прием на храна в стационарно състояние са необходими за всяко проучване, целящо да разбере ефектите от храненето върху продължителността на живота.

Нашите резултати директно противоречат на дългогодишното предположение, че манипулацията с храна влияе върху продължителността на живота на мухите само чрез промени в поглъщането на хранителни вещества. Тъй като този погрешен възглед прониква в полето от самото му създаване (11), нашите наблюдения налагат внимателно преразглеждане на цялата работа на Drosophila DR. Всяко прозрение, произтичащо от работата върху плодовите мухи (18–20, 24, 35, 36), е потенциално объркано от промените в хидратацията и поради това е трудно да се екстраполира на DR на бозайници. Това предупреждение се разпростира върху многобройните мутанти, за които е показано, че регулират мухата DR (например, 37, 38). Ще се изисква широко валидиране, за да се оцени тяхната стойност като улики за DR и стареене при висшите организми. Всяка бъдеща работа трябва да използва условия, при които водата ad libitum присъства или е доказано, че не влияе на продължителността на живота.

Експериментални процедури

Реактиви.

Екстрактът от агар и дрожди Bacto ™ е от BD Diagnostic Systems, захароза от Mallinckrodt Baker, бирена мая от MP Biomedicals и царевично брашно (жълто) от Quaker Oats. Бутилки с дрозофила (полипропилен, 8 унции. Кръгло дъно) и флакони (полистирол, 25 × 95 мм) са закупени от VWR International. За измерване на продължителността на живота в клетките (голяма клетка за събиране на ембриони, Genesee Scientific), храната и водата се доставят в разделени ястия (плочи с четири секции, Fisher Scientific).

Приготвяне на храна.

Хранителните състави са представени в легендите на фигурите. Агар (0,5%, ако храната съдържа царевично брашно, иначе 1%, тегл./Об.) Се нагрява при непрекъснато разбъркване в ddH2O (10–20% по-малко от желания краен обем) на котлон. При кипене се добавят хранителни компоненти и топлината се намалява. След кипене с енергично разбъркване в продължение на 2 минути, храната се отстранява от огъня и крайният обем се регулира с ddH2O. След охлаждане до 70%) среда. Мухите се оценяват за оцеляване и им се осигурява свежа среда на всеки 2-3 дни. Загражденията бяха поставени на случаен принцип в инкубатора и позициите се въртяха след всяко прехвърляне, за да се минимизират ефектите от микроклимата. Статистическата значимост на различните криви на оцеляване беше определена чрез log-rank тест. Анализът на пропорционалните опасности на Кокс също се използва за генериране на съотношение на риска за всеки експеримент в присъствието или отсъствието на вода (Таблица S1). Когато съотношението на риска е близо до 1, DR има малък ефект върху оцеляването.

Измерване на скоростта на подаване.

Анализите на храненето се извършват по същество, както е описано (22). Накратко, възрастни (на възраст 2–5 дни, приблизително 10 мухи/флакон) са били привиквани в продължение на 4 дни върху хранителната среда, която се тества, с преход към прясна храна на втория ден. На 4 ден мухите бяха прехвърлени в същата среда, допълнена с 0,5–4 μCi/mL [α- 32 P] -dCTP (1 До кого трябва да се адресира кореспонденция. E-mail: billjaits.caltech.edu

Принос на автора: W.W.J., G.B.C., B.M.Z., T.B. и S.B. проектирани изследвания; W.W.J., G.B.C., B.M.Z. и E.M.M. извършени изследвания; W.W.J., G.B.C. и B.M.Z. анализирани данни; и W.W.J. и G.B.C. написа вестника.

Авторите не декларират конфликт на интереси.