Резюме

Отдавна е известно, че диабетът и затлъстяването са свързани. Наскоро характеризираният адипоцитен хормон резистин (наричан още FIZZ3/ADSF) е замесен като молекулярна връзка между нарушен глюкозен толеранс (IGT) и затлъстяване при мишки. Търсенето на варианти на последователности в локуса на човешки резистин идентифицира девет еднонуклеотидни полиморфизми (SNP), но няма кодиращи варианти. Изследване на връзката на тези SNP с диабет и затлъстяване разкри два варианта на 5 'фланкиране (g.-537 и g.-420), в силно неравновесие на връзката, които са свързани с ИТМ. При недиабетни индивиди от района на град Квебек и района Saguenay-Lac-St-Jean в Квебек мутацията g.-537 (честота на алела = 0,04) е свързана значително с увеличение на ИТМ (P = 0,03 и P = 0,01, съответно). Когато данните от тези две популации бяха комбинирани и коригирани според възрастта и пола, както g.-537 (съотношение шансове [ИЛИ] 2,72, 95% CI 1,28-5,81), така и g.-420 варианти (1,58, 1,06-2,35) ) са били свързани с повишен риск за ИТМ ≥30 kg/m 2. За разлика от това, при популации от случай/контрол и семейни проучвания от Скандинавия, не видяхме ефект върху ИТМ с нито един от тези варианти на промотор. Не се наблюдава връзка с диабет в нито една от популационните проби.

варианти

Приблизително 80% от пациентите с диабет тип 2 са с наднормено тегло или затлъстяване. Смята се, че нарастващата степен на затлъстяване (1,2) влияе пряко върху нарастващото разпространение на диабет тип 2 в Северна Америка (3). Напоследък се предполага, че хормонът резистин (присъединителен номер NM_020415) играе роля в връзката на тези две сложни черти (4). Резистинът принадлежи към семейство секретирани пептиди (5,6), които споделят богат на цистеин СООН-край и образуват дисулфидно свързани хомодимери (7). Резистинът е идентифициран в мишката чрез скрининг на диференцирани адипоцити за гени, репресирани от антидиабетното лекарство розиглитазон, член на класа на сенсибилизиращи инсулина лекарства, известни като тиазолидиндиони (TZD), за които се смята, че са насочени към пероксизомен пролифератор-активиран рецептор (PPAR) - γ (рев. в 8). Резистинът на мишката се експресира изключително в адипоцити (4,9) и инхибира тяхната диференциация в културата (9). Циркулиращите нива на резистин се повишават след хранене с високо съдържание на въглехидрати (9) и при генетично и диетично затлъстяване (4). При мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, антирезистиновите антитела подобряват кръвната захар и действието на инсулина (4). Човешкият резистин се експресира само при ниски нива в мастната тъкан (10,11) и неговият принос за тези болестни състояния е неясен.

Тъй като не са открити варианти на кодиране и вариантите на промотора вероятно ще играят важна роля в сложни черти, ние избрахме първо да проучим SNP на промотора за възможна връзка с диабет или ИТМ. Започна проучване за асоцииране, за да се изследват още два често срещани 5 'фланкиращи SNP (g.-537A> C и g.-420C> G) в случай на диабет тип 2/контролна проба от Saguenay-Lac-St-Jean (SLSJ ) регион на Квебек и извадка от популация от мъже от района на град Квебек (QC). Разпределението на генотипа за тези два варианта не се различава значително от равновесието на Харди-Вайнберг нито в случая на QC, нито в SLSJ/контролната проба. В допълнение, честотите на алелите в тези две проби не се различават значително. За да се оцени връзката на полиморфизмите g.-537A> C и g.-420C> G с диабет тип 2, ние сравнихме честотите на алелите на тези варианти в извадката за случай/контролно проучване на пациенти с диабет и недиабет, наети от района на SLSJ. Както е показано в таблица 1, не се наблюдава разлика в честотата на алелите между диабетните и недиабетичните субекти тип 2. В логистичен регресионен модел, включващ възраст и пол, нито резистиновият g.-537A> C полиморфизъм, нито g.-420C> G полиморфизмът са допринесли значително за диабета (данните не са показани).

В QC пробата повишението на ИТМ (30,4 срещу 29,2 kg/m 2, P = 0,03) е свързано с наличието на g.-420 G алел в сравнение с C/C генотипа (фиг. 2А). По същия начин установихме връзка с присъствието на алела g.-537 C в сравнение с A/A генотипа за ИТМ (31,8 срещу 29,7 kg/m 2), което също беше значително (P = 0,03) (Фиг. 2B ), въпреки ниската честота (3,9%) на този алел. В допълнение, няколко индекса на затлъстяване са значително свързани с алела G при g.-420: тегло (92,8 срещу 87,9 kg, P = 0,006), телесна мастна маса (27,8 срещу 25,4 kg, P = 0,03) и талия обиколка (102,9 срещу 100,0 cm, P = 0,04) (Таблица 2). Всички тези същите параметри са били засегнати от алела С в позиция g.-537. Всички разлики остават статистически значими след корекция за възрастта (данните не са показани).

Използвайки логистичен регресионен анализ, ние изчислихме коефициенти на шансове (ИО) за ИТМ> 30 kg/m 2. Имаше силно съгласие между OR за QC и пробите от изследването SLSJ, когато бяха изследвани само недиабетни индивиди. И за двете групи OR е> 1,5 за g.-420G вариант и> 2,7 за g.-537C вариант (Таблица 3). И накрая, за всички недиабетни субекти, взети заедно, ORs за G алела при g.-420C> G и C алела при g.-537A> C са 1,58 (CI 1,06-2,35, P = 0,025) и 2,72 (1,28-5,81), P = 0,01), съответно когато възрастта и полът са включени в модела (Таблица 3).

Алелите g.-420 G и g.-537 C са в значителна LD помежду си. В изследваните досега 590 индивиди от Квебек, алелът С в позиция g.-537 присъства само при индивиди, носещи G алел в позиция g.-420. Наблюдавахме, че средният ИТМ на тези недиабетни индивиди, притежаващи алел C в позиция g.-537 (и по този начин притежаващи и двата варианта) е по-висок от тези, притежаващи само G алел в позиция g.-420 (P = 0,006).

Възможно е някой от тези 5 'полиморфизми да промени мястото на свързване на транскрипционен фактор, засягащо нивата на резистин иРНК. Търсенето на потенциални места за свързване на позиции g.-420 и g.-537 с MatInspector V2.2 (18) разкрива няколко мотива на транскрипционен фактор, променени от тези варианти алели (напр. Сайт AP1 е унищожен от g.-537A> C ). Въпреки че прецизните механизми, контролиращи транскрипцията на резистин, трябва да бъдат изяснени, един доклад включва бета-адренергичните рецептори и протеин киназата А в намалена експресия на резистин (19).

Опитахме се да повторим откритието си в скандинавските проучвани популации. Няма значителна връзка между двата варианта на резистинов промотор и затлъстяването в тези описани по-рано (12) популации от проучване, които включват случай на диабет/контролна проба (Таблица 1), триади на диабет и нормални тройки, толерантни към глюкоза (QTDT, данните не са показани ). В случая на g.-537 това може да се дължи на факта, че редкият алел е имал честота 0,02 в скандинавския случай/контролна проба, значително по-ниска от 0,04, наблюдавана в Квебек (P = 0,005, точен тест на Фишър) (Таблица 1) . Три други алтернативи могат да обяснят липсата на репликация на промоторните варианти: 1) взаимодействащите локуси или условията на околната среда се различават между тези две популации и влияят върху фенотипната експресия на вариантите; 2) резистиновите полиморфизми от Квебек са в LD с друг функционален вариант в този или друг ген, докато скандинавската проба може да бъде в равновесно свързване с тази друга мутация; или 3) находката в популациите на Квебек е фалшива.

Понастоящем се знае много малко за функцията на резистин при хората и нивото на експресия в човешката мастна тъкан остава противоречиво (10,11,20,21). Въпреки това Savage et al. (11) откриват резистин по-често в мазнините на заболелите от затлъстяване, отколкото при нормалните контролни субекти, и McTernan et al. (20) установи увеличение на резистина в коремните мазнини в сравнение с бедрото. Нашите резултати демонстрират повишен риск от по-висок ИТМ за носители на два полиморфизма на резистинови промотори сред френските канадци в Квебек. Интересното е, че наблюдаваният ефект изглежда най-силен при недиабетни пациенти. При недиабетни субекти промяната в нивото на резистин може да допринесе за затлъстяване, вероятно в резултат на неправилно регулирана транскрипция, която има други физиологични последици при пациенти с диабет. Алтернативно, базалната или активирана транскрипция на резистин при пациенти с диабет може да е различна. Измерването на нивата на резистин при индивиди с тези варианти може да допринесе за характеризирането на резистиновия промотор. Повишеният риск от затлъстяване, предоставен от вариантите на резистин в тези популации, изисква допълнителни проучвания в по-големи проби от популацията.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Проби от населението.

Случаят на диабет/контролна проба (n = 359, средна възраст 52,0 години) е описан другаде (15). Накратко, изследваната популация се състои от новодиагностицирани субекти с диабет тип 2 (критерии на Световната здравна организация от 1998 г.) (22) от SLSJ и контролни субекти, съобразени с възрастта и пола (нормален глюкозен толерант). Някои лица също са били включени в семейно проучване на 79 семейства (424 индивида). Пробата за QC, състояща се от 231 мъже (средна възраст 42,4 години) и избрана за широк диапазон на затлъстяване, е описана по-рано (16). Накратко, тези субекти са били заседнали, не пушат и не съдържат метаболитни нарушения, изискващи лечение, като диабет или хипертония. Скандинавската извадка от случаи/контрола (n = 968, средна възраст 60,5 години) и популациите от семейни проучвания са описани другаде (12). Накратко, субектите са имали диабет или тежък IGT, а контролните субекти са били съпоставени по пол, възраст и географско местоположение. Скандинавските проучвания, базирани на семейството, се основават на трио, при които потомството е имало или диабет тип 2 (n = 126), IGT (n = 108), нарушена глюкоза на гладно (n = 99) или нормален глюкозен толеранс (n = 379) . Пациентите са дали информирано съгласие и протоколите за изследвания са били наблюдавани от местните институционални съвети за преглед.

Последователност.

Температурите за отгряване на грунда бяха 56–60 ° C. Условията за PCR бяха 50 ng геномна ДНК, 1,25 единици Qiagen HotStart Taq (Qiagen, Мисисауга, Онтарио, Канада) (1,5 mmol/l MgCl2,), 0,2 mmol/l dNTPs и 0,4 μmol/l праймери в 50-μl реакция. PCR продуктите се пречистват (Mulitiscreen; Millipore, Bedford, MA) и секвенирането се извършва с помощта на BigDye Terminator (версия 2.0) и се анализира на ABI 3700 секвенсори (Applied BioSystems, Foster City, CA). Данните бяха обработени с помощта на софтуера за анализ на последователността (версия 3.6) и след това бяха подравнени с Autoassembler 2.1 (Applied BioSystems). Всички екзони, границите на сплайсинг на екзон-интрон и промоторът на резистин бяха скринирани (вижте по-долу за праймери) чрез секвениране на двама индивиди от Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) и 45 индивида от SLSJ и QC, състоящи се от затлъстели и нонобези пациенти (или недиабетни, или пациенти с диабет тип 2). PCR продуктите показват очакваните дължини, в съответствие с липсата на заличавания, дублиране или пренареждане.

Резистинови праймери за секвениране.

Праймерите бяха както следва: промотор F: tgtcattctcacccagagaca; промотор R: tgggctcagctaaccaaatc; екзон 1–2F: gggacttattagccaagcca; екзон 1–2R: tgggttggagtcaggtctgt. Intron 2F: gagaggatccaggaggtcg; intron 2R: aggtgacgctctggcact. Exon 3F: acagggctaggggaggatg; екзон 3R: agtagaggctggacacggg. Exon 4F: cctcagcctcccagctca; екзон 4R: agacgctagatcagtccctcc.

Статистически методи.

Сравненията на честотата на алелите и разпределението на генотипа бяха оценени с помощта на алгоритмите на Raymond и Rousset (23). Анализите на Харди-Вайнберг бяха извършени въз основа на алгоритъма на Weir (24), като се използва Genetic Data Analysis (GDA) Версия 1.0 (d12) от P.O. Луис и Д. Зайкин, достъпни на http://lewis.eeb.uconn.edu/lewishome/gda.html.

Преди анализи, разпределението на ИТМ, теглото, телесната мастна маса, обиколката на талията и коремната мастна тъкан (от компютърна томография) бяха тествани за изкривяване и куртоза и всички променливи бяха съответно под една и четири. Средните антропометрични стойности бяха сравнени между класовете по генотип, като се използва t тест на Student. ANCOVA се използва за коригиране на антропометрични променливи за възрастта. Логистичните регресионни анализи бяха извършени върху зависимата променлива, затлъстяване, определена като ИТМ ≥30 kg/m 2 за затлъстяване спрямо BMI 2 за неносебирани пациенти. ИЛ бяха коригирани за възраст и пол. Статистическите анализи бяха извършени със статистическия пакет SAS (SAS Institute, Cary, NC). Всички представени стойности на Р са номинални, тъй като не са направени корекции за многократно тестване. QTDT са извършени със софтуера QTDT версия 2.2.1 (достъпен на http://www.well.ox.ac.uk/asthma/QTDT), като се използва модел на ортогонална асоциация (25).

SNP в резистин. Схематично представяне на локуса на гена на човешки резистин (FIZZ3) и екзон структура и местоположение на осем SNP. Малките честоти на алелите, получени от всички изследвани проби в Квебек, са в скоби (на базата на> 300 проби за всички SNPs с изключение на IVS3 + 30, която се основава на 45 проби). Номерирането на SNP се основава на присъединителния номер на GenBank. AF205952.

Среден ИТМ по генотип за g.-420 (A) и g.-537 (B). A: •, CC генотип; Combined, CG и GG генотипове комбинирани. B: •, АА генотип; Combined, AC и CC генотипове комбинирани. Ленти за грешки = SE на средната стойност. Стойностите на P от t тест на Student са показани над всяко сравнение. DBT, диабетик; всички не-DBT, всички недиабетни пациенти от SLSJ, комбинирани с QC проби.

Честоти на генотипа на 5 'фланкиращи SNP в локуса на резистина

Характеристики на субектите по генотип в QC пробата на недиабетни мъже

Логистични регресионни анализи за ИТМ> 30 kg/m 2 за 5 'фланкиращи SNP в резистивен локус

Благодарности

Това проучване беше частично финансирано от договор за научни изследвания от Bristol-Myers Squibb, Millennium Pharmaceuticals и Affymetrix. Скандинавското проучване е подкрепено с безвъзмездна финансова помощ от Фондация Сигрид Юслиус. J.C.E. е получател на докторантура от Националния институт по здравеопазване (NIH). M.-C.V. е изследовател от Fonds pour la Formation des Chercheurs et l’Aide à la Recherche. S.M.W. получил подкрепа за заплата от NIH. JC.L.-O. беше подкрепена от изследователския институт за обща болница в Монреал/Математика на информационните технологии и сложни системи (Мрежа от центрове за върхови постижения) следдокторска изследователска стипендия. J.N.H. е получател на докторска стипендия за лекари от Медицинския институт на Хауърд Хюз и награда за кариера на Бъроуз Уелкъм в областта на биомедицинските науки. J.P.D. е професор по човешко хранене, липидология и профилактика на сърдечно-съдови заболявания, подкрепена от Provigo и Pfizer Canada. D.G. е председател на канадския изследователски стол по превантивна генетика и геномика на общността. T.J.H. е носител на награда за учен канадски институт по здравни изследвания.

Благодарим на лицата, които доброволно се включиха в проучванията както в Квебек, така и в Скандинавия, както и на персонала на Центъра за геноми в Монреал, Липидния изследователски център в КК и Липидната изследователска група в болница Chicoutimi. Благодарим също на L. Coderre, R. Sladek, T. Pastinen, C. Greenwood, M. Fujiwara, N. Roslin, K. Morgan, E. Lander и L. Pérusse за полезни дискусии.

Бележки под линия

Адресирайте кореспонденцията и исканията за препечатване до д-р Томас Дж. Хъдсън или д-р Джеймс С. Енгерт, Център за геном в Монреал, MGHRI/MUHC, Монреал, Квебек, Канада H3G 1A4. Имейл: tom.hudsonmcgill.ca или jamie.engertstaff.mcgill.ca .

Получено за публикуване на 12 ноември 2001 г. и прието в преработен вид на 22 януари 2002 г.

Д.А. е член на Консултативния съвет по клинична геномика в Merck Research Labs, компания, която предлага лекарства, използвани за лечение на диабет. Той също така е член на Научно-консултативния съвет на Genomics Collaborative, компания, която извършва изследвания за диабета. Нито една от фирмите не е участвала в изследването, описано в това проучване. T.J.H. е получил грантова/изследователска подкрепа от Bristol-Myers Squibb, Millennium Pharmaceuticals и Affymetrix. Част от тази безвъзмездна помощ е използвана за финансиране на това изследване.

* J.C.E., M.-C.V. и S.M.W. допринесе еднакво за това проучване.

J.C.E., M.-C.V. и S.M.W. допринесе еднакво за това проучване.

IGT, нарушен глюкозен толеранс; LD, неравновесие на връзката; ИЛИ, коефициент на коефициент; PPAR, рецептор, активиран от пероксизомен пролифератор; QC, град Квебек; QTDT, количествен тест за неравновесно предаване; SLSJ, Saguenay-Lac-St-Jean; SNP, еднонуклеотиден полиморфизъм; TZD, тиазолидиндион.