Институт по репродуктивна и развитие на биологията, Имперски колеж Лондон, Лондон, Великобритания, Федерален университет в Санта Мария (UFSM), Санта Мария, Бразилия

неговите

Партньорски институт по репродуктивна и развитие на биологията, Imperial College London, Лондон, Великобритания

Партньорски институт по репродуктивна и развитие на биологията, Imperial College London, Лондон, Великобритания

  • Фабио В. Комим,
  • Кейт Харди,
  • Стивън Франкс

Фигури

Резюме

Цитат: Comim FV, Hardy K, Franks S (2013) Адипонектин и неговите рецептори в яйчника: допълнителни доказателства за връзка между затлъстяването и хиперандрогенизма при синдром на поликистозните яйчници. PLoS ONE 8 (11): e80416. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0080416

Редактор: Cornelis B Lambalk, VU University Medical Center, Холандия

Получено: 12 май 2013 г .; Прието: 2 октомври 2013 г .; Публикувано: 18 ноември 2013 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Съвета за медицински изследвания (MRC) Великобритания (безвъзмездна помощ по програма G0802782); FVC беше подкрепен от Capes Foundation (бразилско министерство на образованието), Бразилия. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Синдромът на поликистозните яйчници (СПКЯ) е най-често срещаното ендокринно разстройство при жените, засягащо 5-10% от жените в репродуктивна възраст [1,2]. Хиперандрогенизмът е отличителен белег на СПКЯ и произхожда предимно от тека-интерстициалните клетки на яйчниците, които се характеризират с повишен капацитет за андрогенна биосинтеза [3-6].

Производството на андроген значително се увеличава при СПКЯ в присъствието на затлъстяване, което се дължи, поне отчасти, на ефекта на по-високите от нормалните нива на инсулин върху функцията на тека клетките [7]. Въпреки това е изтъкната възможна роля на цитокиновите продукти от мазнини (адипокини) като връзка между репродуктивните и метаболитните аномалии [8]. В тази връзка количествено и функционално адипонектинът (30kd протеин) се счита за един от най-важните адипокини в човешката физиология [9]. Той се различава от повечето други адипокини, като има онова, което изглежда като защитен ефект върху развитието на затлъстяване. Той има сенсибилизиращи инсулина и изгарящи мазнини свойства, подобни на лептина, но също така е доказано, че има антиоксидантни и антиатерогенни ефекти [9,10]. Неговите серумни нива са обратно свързани с мастната маса и са положително свързани с по-нисък риск от диабет тип 2 [9,11]. Въпреки че са докладвани анормални серумни нива на различни адипокини в СПКЯ [12-19], малко проучвания разглеждат ефектите на адипокините върху репродуктивните тъкани [20,21].

Нивата на адипонектин варират малко по време на менструалния цикъл [22]. Въпреки това се предлага роля на адипонектин в зреенето на яйцеклетките, пролиферацията и смъртта на гранулозните клетки и като модулатор на секрецията на естрадиол и прогестерон [8,21,23,24]. Малко се знае за неговите ефекти върху стероидогенезата в тека клетките, но Спайсър и колегите му забелязват, че добавянето на адипонектин към първичните говежди тека клетки (ТК), култивирани в присъствието на лутеинизиращ хормон (LH) и инсулин, намалява производството на андростендион и прогестерон [20, 25]. Към днешна дата тези предварителни констатации не са нито потвърдени, нито противоречиви. Адипонектиновите рецептори са частично характеризирани в гранулоза-лутеиновите клетки, получени от жени, подложени на ин витро оплождане [8], но няма системни проучвания при яйчници при жени с СПКЯ.

В настоящото проучване ние демонстрираме намаляване на експресията на адипонектиновите рецептори в тека клетките от поликистозни яйчници в сравнение с теките от нормалните яйчници. Освен това, ние показваме чрез потискане на генната експресия чрез малка интерферираща РНК (siRNA), че адипонектинът, основният адипокин при хората, намалява производството на андрогени в тека клетките in vitro. Ето защо предлагаме нов механизъм на взаимодействие между метаболизма на мастните клетки и стероидогенезата при СПКЯ, който може да помогне да се обясни защо хиперандрогенията е по-тежка при затлъстели и с наднормено тегло, отколкото при слаби жени с СПКЯ.

Материали и методи

Анализ на човешките яйчници

Секции от архивирани човешки яйчници (фиксирани във формалин и вградени в парафин), събрани между 1993 и 2003 г. от пациенти на възраст под 50 години с доброкачествено гинекологично заболяване, са получени от Хистопатологичната банка на болница „Света Мери“ (Imperial College Healthcare NHS Trust) в Лондон, както беше описано по-рано [26,27]. Като цяло, с изключение на пробите, считани за некласифицирани или имащи съпътстваща патология, 25 проби, 16 PCO и девет контролни яйчници бяха на разположение за анализ. От 16 жени с СПКЯ 11 са имали доказателства за редовни овулаторни цикли, а пет са имали олигоменорея или нередовна менструация (по-подробни клинични подробности са дадени в таблица S1). Всички проби са събрани с предварително информирано съгласие на пациентите и в съответствие със Закона за човешката тъкан и местната комисия по етична изследователска дейност (2002/6400). В допълнение към хистологичната информация са получени клинични данни, включително анамнеза за менструалния цикъл и ултрасонография на яйчниците (вж. Таблица S1). Тези данни бяха използвани за установяване на ясна диагноза на СПКЯ [28].

Подготовка на проби и имунохистохимия и анализ на изображения

Първична култура от говежди тека клетки

Нокдаун на ген за адипонектинови рецептори, qPCR и RT-PCR

Статистически анализ

Където е уместно, анонимизираните данни се съхраняват във файлове на Microsoft Excel. Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуера Instat3 (Graphpad Software, Сан Диего, САЩ). Разликите между групите бяха тествани с помощта на t-критерия на Student (ако е нормално разпределение) или теста на Mann-Whitney (ако е асиметрично разпределение). За сравнение на повече от две групи с нормално разпределение са използвани еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) и допълнителен пост-тест (тест на Tukey’s или Dunnet’s); за данни с асиметрично разпределение бяха използвани теста на Крускал-Уолис и множествения сравнителен тест на Дън. Във всички случаи вероятностна стойност (p) по-малка от 0,05 се счита за статистически значима. Обикновено разпределените данни са представени със средно плюс SEM или SD.

Резултати

Намалена експресия на адипонектинови рецептори (AdipoR1 и AdipoR2) в тека клетките от поликистозни яйчници

Няма значителна разлика между жените със или без PCO във възрастта (средно [SEM] PCO 33,7 [1,1] спрямо нормалното 33,2 [1,2] години) или ИТМ (26,8 [2,0] срещу 22,6 [1,7] kg/m 2). Само 3 жени в тази серия (всички с anovPCO) са били със затлъстяване (ИТМ> 30), а четири други (1 нормално, 3 овПКО) са с наднормено тегло (ИТМ> 25, 0,05) (Фигура 1д). Поради потенциалния ефект на затлъстяването върху експресията на адипонектинови рецептори, сравнихме пропорциите на фоликулите при жени с PCO, които експресираха Adipo R1 и AdipoR2 в теката при жени с наднормено тегло или затлъстяване с експресия в theca от слаби субекти на PCO. Няма значителна разлика в дела на фоликулите на Adipo R1 между жени с наднормено тегло или затлъстяване и слаби жени като цяло или между жени с наднормено тегло и наднормено тегло с PCO (средно [SD] постно PCO, 0,33 [0,05] спрямо PCO с наднормено тегло, 0,30 [0,05]. Подобни резултати бяха наблюдавани по отношение на Adipo R2 (постно PCO, 0,67 [0,02] спрямо наднормено тегло 0,67 [0,04]).

Както AdipoR1 (Фигура 1а), така и AdipoR2 (Фигура 1b) са открити в гранулоза (G) и тека (T) на антрални фоликули (вложките показват контролни [отрицателни] секции). Пропорциите на тека и гранулозните клетки, експресиращи протеин за адипонектинови рецептори I & 2 (AdipoR1 и AdipoR2) във фоликули от нормални и поликистозни яйчници, са показани в стълбовидните графики. Анализирани са общо 920 фоликула. Значително намаляване на дела на TC, маркирани за (c) AdipoR1 и (d) AdipoR2, е демонстрирано при поликистозни яйчници в сравнение с нормални яйчници от здрави жени (* p = 0,002, ** p = 0,049, Mann-Whitney). Не са открити разлики между PCO и контролната тъкан в дела на гранулозните клетки, маркиращи за AdipoR1 (e) или AdipoR2 (f). Показаните данни са средно + SEM при до 7 нормални и 15 поликистозни яйчници.

Адипонектинът регулира производството на андроген от тека клетките

Инкубацията на TCs с адипонектин в присъствието на LH и инсулин води до значително намаляване на нивата на андростендион в средата, за разлика от малко, но значително увеличение на нивата на андростендион, наблюдавано при лечение с лептин и висфатин (но не и резистин). В лекуваните с лептин и висфатин клетки нивата на андростендион в средата са съответно (средно ± SD) 0,63 ± 0,04 и 0,64 ± 0,08, и двете значително по-високи от нивата, открити в контролните кладенци 0,54 ± 0,08 (р = 0,001; Крускал -Тест на Уолис и тест за множество сравнения на Дън) (Фигура 2). Потискащият ефект на адипонектин върху андрогенната секреция е отбелязан отново в клетки, третирани с LH в отсъствие на инсулин, където нивата на андростендион (средно ± SD; 0,77 ± 0,11 ng/ml) са 49% от тези, отбелязани в контролните клетки (1,57 ± 0,26 ng/mL) (фигурата не е показана). В същия експеримент нито лептинът, нито висфатинът предизвикват значителна промяна в производството на андроген.

Клетките се култивират в присъствието на LH (10 ng/mL). Ефектът на адипонектин се изразява като дял на генната експресия в контролните (нетретирани) говежди тека клетки. Отбелязано намаляване на генната експресия на (a) LHR (* p = 0,02) (b), STAR (** p = 0,028) (c) CYP11A1 (*** p = 0,02) и (d) CYP17 (*** * p = 0,012) са наблюдавани в тека клетки от говеда след 24-часово третиране с адипонектин (3 μg/ml). Данните са показани като средна стойност (95% ДИ).

Потискането на адипонектиновите рецептори води до засилено производство на андроген

За да се обърне внимание на ролята на адипонектин в регулирането на производството на андроген в TCs, беше извършено нокдаун на гените, кодиращи адипонектинови рецептори, AdipoR1, AdipoR2 и техния общ ефектор протеин, APPL1, използвайки специфични siRNAs. Както се очаква, TC, третирани с адипонектин, показват намаляване на производството на андростендион: намаление с около 40% в сравнение с базовото ниво 24 часа преди лечението (Фигура 4). Подобно намаление (30% намаление) се наблюдава в присъствието на разбъркана (контролна) siRNA. За разлика от това, специфичният генен нокдаун води до увеличаване на секрецията на андростендион, достигайки над 100% от базовото ниво: 119% до 136% от базалното (само лечение с адипонектин) за AdipoR1 siRNA, 170% до 266% за AdipoR2 siRNA и 177% до 257% за APPL1 siRNA (Фигура 4). По този начин инхибирането на функцията на адипонектиновите рецептори в тека клетките е довело до засилено производство на андрогенна секреция, което предполага, че адипонектинът има важна физиологична роля в ограничаването на производството на андроген от яйчниците.