Експериментално
и терапевтични
Лекарство

• Последните две години
• Обща сума

• Миналата година 0
• Обща сума

• Миналият месец
• Изминалата година
• Обща сума

• Сюян Ма
• Юмей Хуанг
• Ин Дин
• Лей Ши
• Сяолин Чжун
• Минг Канг
• Чанпинг Ли

Тази статия се споменава в:

Резюме

Въведение

Взаимодействащите Р-елементи на Wimpy тестиси (PIWI) РНК (piRNAs) са идентифицирани за първи път през 2006 г. в зародишните клетки на яйчниците на Drosophila. Тези РНК са къси некодиращи РНК, измерващи 24-32 нуклеотиди и изпълняват своите биологични функции, като взаимодействат с протеина Piwi, за да образуват комплекси, индуцирани от piRNA, заглушаващи (piRISC) комплекси (11-13). Доказано е, че piRNAs могат да имат биологична роля в заглушаването на транспозона, генната регулация, експресията на протеини, пренареждането на генома и поддържането на репродуктивните стволови клетки (12). Предишни проучвания също съобщават, че piRNAs се диференцирано експресират в различни тумори, ревматоиден артрит, стареене на човека, регенерация на невронални аксони и устойчивост на химиотерапия (14-18). Освен това, като ключови протеини в подпомагането на биологичната роля на piRNAs, протеинът Piwi, свързан с piRNAs, показва същите характеристики. Например, експресията на Piwi-подобен протеин 1 (PiwiL1) в тумори значително корелира с хистологична степен на тумор, клиничен стадий и лош клиничен резултат (11).

Доколкото ни е известно, по-рано не се съобщава за пряка връзка между NAFLD и piRNA. Следователно, в настоящото проучване, експресията на piRNA в NAFLD се анализира, използвайки пиРНК генния чип и последващи техники на биоинформатика. По този начин настоящите резултати могат да предоставят основа за бъдещи изследвания на ролята на piRNAs в патогенезата на NAFLD.

Материали и методи

Животни и материали

C57BL/6 мишки са закупени от Chongqing TengXing Biotechnology Co. Ltd. (n = 20; тегло, 20 g; възраст, 8 седмици). Диети с дефицит на метионин и холин (MCD) и диети с метионин и холин (MCS) са закупени от Trophic Animal Feed High-tech Co., Ltd. Аланин аминотрансфераза (ALT; кат. № C009-2 ), аспартат аминотрансфераза (AST; кат. № C010-2), общ холестерол (TC; кат. № A111-1) и комплекти за анализ на триглицериди (TG) (кат. № A110-1) са закупени от Nanjing Jian Институт по биоинженерство Ченг. Експериментите с масив Arraystar MM9 piRNA и микрочипове са извършени от Kang Chen Bio-Tech, Inc. Реагент за екстракция на РНК TRIpure ®, cDNA EntiLink ™ 1st Strand и EnTurbo ™ SYBR Green PCR SuperMix са закупени от ELK (Wuhan) Biotechnology Co., ООД.

Модел NAFLD на мишка

Общо 20 мъжки мишки C57BL/6 бяха разделени на случаен принцип в две групи. След това 10 мишки от контролната група бяха хранени с MCS диетата, докато останалите 10 мишки от моделната група бяха хранени с MCD диетата. Всички мишки бяха хранени в продължение на 8 седмици в чиста стая със свободен достъп до вода и храна (температура, 20 ± 5 ° C; влажност, 50%; 12/12 h светлина/тъмни цикли). Мишките се претеглят редовно и индексът на черния дроб се изчислява, като се използва следната формула: (Черно черно тегло/телесно тегло на мишки) x100%. За да се облекчи болката по време на жертвоприношението, мишките първо се претеглят и след това им се дава дълбока упойка чрез интраперитонеално инжектиране на 10% хлоралхидрат (доза, 500 mg/kg). Смята се, че мишките са в състояние на дълбока анестезия след пълна мускулна релаксация, изчезване на роговичния рефлекс и липса на отговор на външни стимули. След това мишките бяха жертвани чрез дислокация на шийката на матката и смъртността беше оценена по невъзможността да се наблюдават дихателните движения в гръдния кош и неспособността да се усети сърдечния ритъм.

Хистопатологично изследване на черния дроб

След като мишките бяха жертвани, беше направен надлъжен разрез в средата на корема, за да се разкрие коремната кухина, а коремната кожа, мускулите и фасциите постепенно бяха разделени. Чернодробната тъкан беше напълно изложена и изолирана и беше измерено влажното тегло на чернодробната тъкан. Прясна чернодробна тъкан се поставя във фиксиран разтвор за 24 h при 4 ° C (4% неутрален формалдехид), последвано от алкохолна дехидратация и заместване на ксилол на алкохола в тъканта. След това беше извършено вграждане на парафин и чернодробната тъкан беше нарязана на 5-um участъци. След това тези срезове се инкубират при 45 ° С за 2 часа и се оцветяват с 0,4% хематоксилин за 2-3 минути при 25 ° С и 0,5% еозин (H&E) за 1 минута при 25 ° С. Впоследствие чернодробната тъкан беше оценена чрез оценка на активността на NAFLD (NAS) (19). NAS (0-8 точки) се оценява чрез i) степатоза на хепатоцитите: 0 точки (66%; ii) възпаление в чернодробната лобула (броят на некротичните огнища при увеличение x20): 0 точки, няма; 1 точка, 4; и iii) балониране с хепатоцити: 0 точки, няма; 1 точка, рядко; 2 точки, много. NASH беше изключен, ако NAS беше 4.

Определяне на серумни биохимични индекси

След като мишките бяха умъртвени, кръвни проби (2 ml) от мишките бяха получени чрез орбитално събиране. Впоследствие кръвните проби се центрофугират при 110 х g за 10 минути и се събира 1 ml плазма. Серумните нива на ALT, AST, TG и TC бяха определени с помощта на комплекти за анализ на AST, ALT, TC и TG (Институт по биоинженерия Nanjing Jian Cheng), съгласно инструкциите на производителя.

Качествен контрол на общата РНК в чернодробните тъкани

Общата РНК се екстрахира с TRIzol ® реагент (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) съгласно инструкциите на производителя. Целостта на РНК се оценява чрез електрофореза върху 1% денатурирани агарозни гелове. Общата РНК на еукариотни проби, изпълнявани върху денатуриращия гел, има отделни ивици от 28S и 18S рРНК. Ако 28S rRNA лентата беше

2 пъти по-силна от 18S рРНК лентата, тогава РНК на тази проба може да се счита за завършена (20). Концентрацията на РНК [оптична плътност (OD) 260], замърсяването с органични съединения (съотношение OD260/OD230) и замърсяването с протеини (съотношение OD260/OD280) бяха измерени с помощта на спектрофотометър NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies; Thermo Fisher Scientific, Inc.). След това беше избрана обща РНК със съотношение OD260/OD280> 1,8 (20).

Анализ на микрочипове на piRNAs

Общо, три чернодробни тъкани от контролни и моделни групи бяха избрани на случаен принцип за откриване чрез Arraystar MM9 piRNA масив. След това от всяка проба се екстрахира 1 ug РНК и цианин 3 (Cy3) се флуоресцентно маркира в 3 'края, използвайки T4 RNA лигаза (кат. № EL0021; Thermo Fisher Scientific, Inc.) чрез метод на РНК лигаза. Анализът на микрочиповете се извършва с помощта на платформата Agilent Array (Agilent Technologies, Inc.). РНК, маркирана с Cy3, се хибридизира с Arraystar piRNA Array в камерите за хибридизация SureHyb на Agilent в продължение на 17 часа при 65 ° C. След това за сканиране на масивите беше използван скенер за микрочипове Agilent DNA (Agilent Technologies, Inc). Изображенията на масива са анализирани от софтуера Agilent Feature Extraction (версия 11.0.1.1; Agilent Technologies, Inc). За нормализиране и обработка на данни за квантили е използван софтуерният пакет GeneSpring GX v11.5.1 (Agilent Technologies, Inc.). Филтрира се промяна на гънките и вулканични парцели за идентифициране на piRNAs със значителна диференциална експресия между двете групи. Освен това, R софтуер (версия 3.1.2; https://www.r-project.org/) е използван за създаване на йерархично клъстериране.

Биоинформатичен анализ

miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do) беше използван за търсене на потенциални целеви гени на диференциално експресираните piRNAs (21,22). Функцията и сигналните пътища на целевите гени са предсказани от Gene Ontology (GO; http://geneontology.org/) и Киото Енциклопедия на гени и геноми (KEGG) пътища анализи (KEGG; http://www.genome.jp/ kegg/ko.html).

Откриване на експресия на piRNA чрез PCR с обратна транскрипция (RT-qPCR)

Чернодробните проби се съхраняват при -80 ° C и

100 mg тъкан се събира от леда със стерилизирани инструменти и се смила в 1 ml предварително охладен TRIpure ®. Хомогенатът се излива в епруветка от 1,5 ml ЕР и се прибавя 250 ul трихлорметан, смесва се и се оставя на лед за 5 минути. Сместа се центрофугира при 10 000 х g при 4 ° С в продължение на 10 минути. След това 500 µl супернатант се абсорбират в 1,5-милилитрова ЕР епруветка в ултрачиста работна платформа и се добавя равен обем изопропанол, предварително охладен при 4 ° С, смесва се с главата надолу и се инкубира при -20 ° С за 15 минути . Разтворът се центрофугира при 4 ° С и 10 000 х g за 10 минути, течността се излива внимателно, добавя се 1 ml 4 ° С предварително охладен 75% етанол и се обръща няколко пъти. Утайката от РНК се измива с 75% етанол, центрофугира се при 4 ° С и 10 000 х g за 5 минути, течността се излива и РНК се суши за 5 минути при 4 ° С на чиста работна маса. След това РНК се изпарява изцяло с етанол и се добавят 10 µl вода без РНКаза, за да се разтвори напълно РНК.

Впоследствие комплект за синтез на cDNA от 1-ва верига EntiLink ™ [ELK (Wuhan) Biotechnology Co., Ltd .; котка не. EQ003] се използва за извършване на първа верига кДНК. Сместа от 1.0 µl вътрешен референтен ген-специфичен праймер за обратна транскрипция, 1.0 µl специфичен ген-специфичен праймер за обратна транскрипция, 1.0 µl dNTPs и 15.0 µl РНК се поставя върху PCR инструмент при 70 ° С за 5 минути и след това се охлажда бързо на лед за 2 минути. След това реакционният разтвор се поставя върху лед, последвано от добавяне на 4,0 µl 5X RT буфер, 1,0 µl M-MLV обратна транскриптаза и 1,0 µl инхибитор на RNase и сместа се поставя върху PCR инструмент при 42 ° C за 60 минути и 85 ° C за 5 минути.

RT-qPCR беше извършен с помощта на StepOne ™ RT PCR инструмент (Thermo Fisher Scientific, Inc.) с помощта на Turbo ™ SYBR Green PCR SuperMix комплект [ELK (Wuhan) Biotechnology Co., Ltd .; котка не. EQ001]. Реакционната система беше както следва: 1.0 µl работен разтвор на праймера, 5.0 µl 2X Master Mix, 1.0 µl шаблон, 2.0 µl ddH20 и 1.0 µl Rox. Използвани са следните условия на термоциклиране: Първоначална денатурация при 95 ° С за 3 минути, последвана от 40 цикъла при 95 ° С за 10 секунди, 58 ° С за 30 секунди и 72 ° С за 30 секунди. След това кривата на разтваряне беше изчертана според настройките по подразбиране на инструмента. Относителната генна експресия се изчислява, като се използва 2 - ΔΔ Cq метод (23). Всички експерименти бяха повторени три пъти с U6 като вътрешен референтен ген. Праймерите, използвани в този анализ, са показани в Таблица I.

Таблица I

Олигонуклеотидни последователности на праймерите.

Таблица I

Олигонуклеотидни последователности на праймерите.

• Битка; мастен черен дроб; затлъстяване на болестта чрез идентифициране и заглушаване на генни мутации Генетична грамотност
• Основан на доказателства преглед на употребата на статини при пациенти с безалкохолна мастна чернодробна болест
• Актуализация на фармакологичното лечение на безалкохолна мастна чернодробна болест отвъд начина на живот
• 12 стратегии за отстраняване на мастни чернодробни заболявания - пазари на начин на живот
• 9 признаци на мастна чернодробна болест