М. Л. Лий

1 CENAR и Катедра по молекулярна медицина, Медицински факултет, Университет в Малая, 50603 Куала Лумпур, Малайзия

Н. Х. Тан

1 CENAR и Катедра по молекулярна медицина, Медицински факултет, Университет в Малая, 50603 Куала Лумпур, Малайзия

S. Y. Fung

1 CENAR и Катедра по молекулярна медицина, Медицински факултет, Университет в Малая, 50603 Куала Лумпур, Малайзия

С. С. Тан

2 Биотехнологичен изследователски център, MARDI, P.O. Box 12301, 50744 Куала Лумпур, Малайзия

S. T. Ng

3 Ligno Biotech Sdn Bhd, Taman Perindustrian Balakong Jaya 2, Selangor, 43300 Balakong Jaya, Малайзия

Резюме

1. Въведение

Гъбата се консумира от много общества по целия свят поради нейната вкусност, високи хранителни стойности и фармакологични свойства [1, 2]. Добре установено е, че екстрактите от гъби съдържат голямо разнообразие от съединения като полизахариди, протеини, фибри, лектини и полифеноли, всеки от които може да има свои собствени фармакологични ефекти [3]. Много гъби или техните екстракти могат да се използват като терапевтични агенти и обикновено са известни като лечебни гъби.

Lignosus rhinocerus, тигровата млечна гъба, принадлежи към семейство Polyporaceae и е една от най-важните лечебни гъби, използвани от местните жители в Югоизточна Азия и Южен Китай. В Малайзия гъбата е известна и на местно ниво като „cendawan susu rimau“ - литературна „гъба от тигрово мляко“. Той се използва широко от местните общности в полуостров Малайзия за лечение на различни заболявания, включително рак на гърдата, треска, кашлица, астма, хранително отравяне и като общоукрепващо средство. Гъбата наистина е най-популярната лечебна гъба, използвана от коренното население на Малайзия [4]. В Китай L. rhinocerus sclerotium е скъпо народно лекарство, използвано от традиционните китайски лекари за лечение на рак на черния дроб, хроничен хепатит и стомашни язви [5]. Склероциумът на L. rhinocerus е частта с лечебна стойност. Съществуват обаче много малко проучвания за фармакологичните дейности на гъбата, главно поради ограниченото й предлагане. Гъбата се оказа много трудна за отглеждане и доскоро беше достъпна само чрез събиране от джунглата. Наскоро Тан [6] съобщи за успешно отглеждане на гъбата в агар, твърда и хвърляща хайвер среда с добър добив, като по този начин направи възможно получаването на голямо количество за изследване и терапевтична цел.

Lai et al. [7] беше първият, който изследва антипролиферативните ефекти на склероциалните полизахариди на гъбата. Гъбата, която са използвали за изследване, е наречена Polyporus rhinocerus Cooke (Aphyllophoromycetideae), което всъщност е синоним на Lignosus rhinocerus. Те откриха, че екстрактът от гореща вода на склероциите значително намалява растежа на левкемичните клетъчни линии и Sarcoma S-180, но изненадващо не е разкрит ефект върху клетъчната линия на рака на гърдата [8]. Отбелязва се, че Lai et al. [7] взеха своите проби от микологичен институт в Китай и в доклада им не се споменава метод, използван за потвърждаване на идентичността на гъбата. Нашите наблюдения показаха, че морфологичното идентифициране на гъби от тигрово мляко може да бъде погрешно, тъй като има няколко вида гъби от едно и също семейство, които са сходни по морфология (непубликувано наблюдение). В тази статия ние докладваме нашето изследване на антипролиферативната активност на сорт L. rhinocerus, позитивно идентифициран с генетичен маркер [9], върху клетъчни линии на човешки рак на гърдата и белия дроб и неговата цитотоксичност върху нормалните линии на гърдата и белите дробове.

2. Материали и методи

2.1. Материали

Склероции от сорт L. rhinocerus (TM02, доставен от Ligno Biotech, Selangor, Малайзия), които са положително идентифицирани от техните вътрешни транскрибирани спейсър (ITS) региони на рибозомната РНК [9], бяха изсушени чрез замразяване и смилани на прах с използване на 0,2 mm сито за получаване на светлокафяв, сух пухкав прах с вкус, подобен на мляко. В това проучване са използвани четири клетъчни линии: MCF-7, клетъчна линия на човешки карцином на гърдата; A549, клетъчната линия на човешкия белодробен карцином; 184B5, нормалната човешка клетъчна линия на гърдата; NL 20, нормалната човешка белодробна клетъчна линия. И четирите клетъчни линии са закупени от American Type Culture Collection (ATCC) и са култивирани с различни среди: RPMI-1640 (Lonza, USA) за MCF-7 и A549 клетъчни линии, MEGM Mammary Epithelial Cell Growth Medium (MEGM Bullet kit) ( Lonza, САЩ) за клетъчна линия 184B5 и F12 Medium на Ham (Lonza, САЩ) за клетъчна линия NL 20. Растенията са обогатени с 10% фетален говежди серум (FBS) (Sigma-Aldrich, САЩ) и допълнени с L-глутамин. Клетките се отглеждат във влажен въздух с 5% CO2 при 37 ° С. Всички други използвани химикали са с аналитичен клас.

2.2. Приготвяне на екстракт от студена вода от склероциален прах от L. rhinocerus

10 g прах от склероциален L. rhinocerus се разтварят в 100 ml от milli-Q вода при непрекъснато разбъркване в продължение на 24 часа при 4 ° С. След това сместа се центрофугира при 2 500 х g и супернатантата се събира и лиофилизира.

2.3. Определяне на общото съдържание на въглехидрати и протеини

Общото съдържание на въглехидрати се определя чрез метод на фенол-сярна киселина, както е описано от Dubois et al. [10] като се използва D-глюкоза като стандарт. Концентрацията на протеин се определя по метода на Брадфорд [11], като се използва говежди серумен албумин (BSA) като стандарт.

2.4. Анализ на цитотоксичността

Цитотоксичната активност на екстракта от студена вода на L. rhinocerus се определя по метода на МТТ (3, (4,5-диметитиазол-2-ил) -2,3-дифенил тетразолиев бромид). Този анализ се провежда съгласно метода, описан от Ahn et al. [12] с леки модификации. Клетките с оптимална клетъчна плътност се засяват в 96-ямкова плака и се инкубират една нощ за прикрепване. След това се добавят различни концентрации на екстрактите. След 72 часа инкубация се прибавя разтвор на МТТ и се инкубира в продължение на 4 часа. След това всички разтвори се аспирират и се добавя изопропанол, за да се разтвори кристалът на формазан. След това абсорбцията се определя от четец за микроплаки (Bio-Rad, САЩ) при 595 nm. Всяко измерване се извършва в три екземпляра. Стойността на полумаксималната инхибиторна концентрация (IC50) се определя от процента на жизнеспособността на клетките спрямо крайната концентрация на кривата на екстракта.

2.5. Изследвания на фрагментацията на ДНК

ДНК фрагментацията е използвана за изследване на начина на клетъчна смърт, предизвикан от екстракта от студена вода на L. rhinocerus. Клетките, третирани с IC50 доза екстракт от L. rhinocerus за 72 часа, се събират и лизират в лизисен буфер, съдържащ 1 М Tris-HCI, 0.5 М EDTA, Triton-X и дестилирана вода. ДНК се екстрахира от смес фенол: хлороформ: изоамил (25: 24: 1) и се утаява с еднакъв обем ледено студен изопропанол. След това ДНК пелетата се разтваря в подходящ обем разтвор на RNase (10 mg/mL RNase I) и се инкубира при 37 ° С за 30 минути. ДНК се електрофоризира върху 1,2% агарозен гел, съдържащ GelRed. И накрая, апоптотичните ДНК фрагменти бяха визуализирани под UV трансилуминатор и снимани [13].

2.6. Фракциониране на екстракт от L. rhinocerus

Екстрактът от студена вода на L. rhinocerus sclerotia се фракционира чрез гел-филтрационна колона Sephadex G-50 (2.6 × 40 cm), предварително уравновесена с 0,05 М амониев ацетатен буфер. Елуирането се извършва при скорост на потока 2 mL/min, използвайки 0,05 М амониев ацетатен буфер. Определя се съдържанието на въглехидрати и протеини във всяка фракция. Цитотоксичността (срещу MCF-7 и A549 клетъчни линии) на високомолекулните и нискомолекулните фракции беше изследвана по метода МТТ.

3. Резултати

3.1. Съдържание на въглехидрати и протеини

Екстрактът от студена вода от L. rhinocerus sclerotia (наричан LR-CW) беше лиофилизиран, за да се получи кафеникав прах с добив от около 10% сухо тегло на праха от склероции. Съдържанието на въглехидрати и протеини е определено съответно на 75% и 1,2% от сухото тегло на LR-CW.

3.2. Цитотоксична активност на екстракт от студена вода от L. rhinocerus

Фигура 1 показва ефекта от различните концентрации на LR-CW върху клетъчната жизнеспособност както на човешките клетки на гърдата, така и на белите дробове, както и на човешките нормални клетки на гърдата и белите дробове. Екстрактът от студена вода на L. rhinocerus sclerotia проявява антипролиферативна активност срещу клетки MCF-7 и A549, с IC50 съответно 96,7 μg/mL и 466,7 μg/mL. За сравнение, LR-CW не показва значителен цитотоксичен ефект върху нормалните човешки клетъчни линии на гърдата и белите дробове, със стойности на IC50> 900 μg/mL (Таблица 1).

rhinocerus

Антипролиферативни дейности на екстракта от студена вода на Lignosus rhinocerus sclerotia (LR-CW). Човешки ракови клетки (MCF-7 и A549) и човешки нормални клетки (184B5 и NL 20) се третират с различни концентрации на LR-CWs, вариращи от 15,6 μg/ml до 1000 μg/ml за 72 часа, стойността на IC50 се определя от крива. (а) Цитотоксична активност на LR-CW срещу MCF-7 (плътна линия) и 184B5 (прекъсната линия). (b) Цитотоксична активност на LR-CW срещу A549 (плътна линия) и NL20 (прекъсната линия). Данните са изразени като средна стойност ± SD (n = 3).

маса 1

Цитотоксични дейности (IC50) на екстракт от студена вода от склероции от Lignosus rhinoceros и частично пречистените фракции на екстракта.

Екстракти или фракции MCF-7 (μg/mL) A549 (μg/mL) 184B5 (μg/mL) NL20 (μg/mL)
LR-CW96,7 ± 14,5466,7 ± 43,7906,7 ± 26,7> 1000
Фракция с високо молекулно тегло70,0 ± 5,876,7 ± 3,3NDND
Фракция с ниско молекулно тегло> 1000> 1000NDND

Клетките бяха третирани с екстракт от студена вода от склероции на L. rhinocerus (LR-CW), както и двете фракции, изолирани от LR-CW. MCF-7 и A549 са човешки клетки на гърдата и белия дроб, съответно, докато 184B5 и NL20 са нормални човешки клетки на гърдата и белите дробове, съответно. Времето за лечение е 72 часа. Резултатите, изразени като средна стойност ± SEM (n = 3). ND: не е определено.

3.3. Изследвания на фрагментацията на ДНК

Използвани са изследвания на фрагментация на ДНК, за да се изследва дали LR-CW индуцираната апоптоза. Фигура 2 показва присъствието на фрагменти от ДНК стълба върху третирани с LR-CW клетки MCF-7 и A549, което показва, че клетъчната смърт е медиирана от апоптоза [14]. На нетретирани (контролни) клетки се наблюдава единична лента и няма образуване на ДНК стълба.

ДНК фрагментация в клетки, третирани с екстракт от студена вода на Lignosus rhinocerus sclerotia (LR-CW). Линия 1: 1 kb ДНК стълба. Линия 2: третирани с LR-CW MCF-7 клетки; Линия 3: Третирани с LR-CW A549 клетки. Линия 4: нетретирани MCF-7 клетки. Линия 5: необработени клетки A549.

3.4. Фракциониране на екстракт от студена вода от L. rhinoceros (LR-CW)

Фракционирането на LR-CW чрез гел-филтрационна хроматография Sephadex G-50 дава два основни пика (Фигура 3). Пикът с високо молекулно тегло съдържа както протеини (3,6%), така и въглехидрати (68,7%), докато пикът с ниско молекулно тегло съдържа въглехидрати (31,8%) и много малко количество протеин (0,15%) и други неидентифицирани вещества. Цитотоксичността на тези две фракции беше изследвана с помощта на човешки ракови клетъчни линии MCF-7 и A549. Фигура 4 показва, че фракцията с високо молекулно тегло проявява силна антипролиферативна активност срещу MCF-7 и A549 клетъчни линии, с IC50 от 70.0 μg/mL и 76.7 μg/mL, съответно. Фракцията с ниско молекулно тегло не показва значителна цитотоксичност с IC50> 1000 μg/mL.

Екстрактът от студена вода на L. rhinocerus (50 mg в 5 ml) се фракционира чрез гел-филтрационна хроматография Sephadex G-50. Колоната (2.6 × 40 cm) беше предварително уравновесена с 0.05 М амониев ацетатен буфер. Елюирането се извършва при скорост на потока 2 mL/min и се събират фракции от 3.5 mL. Съдържанието на протеин (- ♦ - ♦ -) беше определено чрез анализ на протеини в Брадфорд (абсорбция при 595 nm), а съдържанието на въглехидрати (- ○ - - ○ - -) беше определено по фенол-сярен метод (абсорбция при 490 nm).

Антипролиферативни дейности на фракции с високо и ниско молекулно тегло от екстракт от студена вода на Lignosus rhinocerus sclerotia (LR-CW). Клетките се третират с различни концентрации на фракциите, вариращи от 7,8 μg/mL до 1000 μg/mL. (а) Най-отгоре: антипролиферативни дейности на фракции с високо и ниско молекулно тегло (плътна линия и прекъсната линия, съответно) срещу клетъчна линия A549. (б) Отдолу: антипролиферативни дейности на фракции с високо и ниско молекулно тегло (плътна линия и прекъсната линия, съответно) срещу MCF-7 клетъчна линия. Данните са изразени като средна стойност ± SD (n = 3).

4. Дискусия

Екстрактът от студена вода на сорта L. rhinocerus съдържа предимно въглехидрати и доста малко количество протеин. Това е подобно на състава на студения алкален екстракт от склероция (82,3% въглехидрати и 1,3% протеин), но много различен от състава на екстракта от гореща вода, който съдържа почти еднакво количество въглехидрати и протеини (37,4% и 41,3%, респ.) [7]. Очевидно по-високата температура, използвана в екстракта от гореща вода, успя да разтвори голямо количество клетъчни структурни/съхраняващи протеини. Фракционирането на LR-CW чрез гел-филтрация Sephadex G-50 дава две фракции, фракцията с високо молекулно тегло, която се появява при обема на кухината (Mol Wt> 30 000) и фракцията с ниско молекулно тегло, която се появява в обема на слоя, представляваща смес от малки молекули. Както фракциите с високо, така и с ниско молекулно тегло съдържат въглехидрати, но протеинът е открит само във фракцията с високо молекулно тегло. Фракцията с високо молекулно тегло може да съдържа полизахарид-протеинов комплекс, както се предполага от Lai et al. [7].

Нашите резултати показват, че LR-CW проявява значителна антипролиферативна активност срещу клетката на рак на гърдата MCF-7 и белодробната клетка A549. Антипролиферативното действие срещу клетки MCF-7 осигурява правдоподобна научна основа за традиционната употреба на L. rhinocerus sclerotia при лечение на рак на гърдата от местните жители на Малайзия. По-рано Lai et al. [7] съобщава, че екстрактът от гореща вода на P. rhinocerus (синоним на L. rhinocerus) проявява антипролиферативна активност срещу различни видове левкемични клетки (с IC50 в диапазона от 100 μg/mL и 400 μg/mL), но не и MCF-7 [8]. Wong и сътр. [15] също така съобщават, че студеният алкален екстракт от гъбата склероция може да стимулира вродените човешки имунни клетки. По този начин изглежда, че L. rhinocerus sclerotia съдържа различни антипролиферативни агенти с различно действие и клетъчна специфичност. Докато веществото в студения алкален екстракт, което засилва имунния отговор, вероятно е β-глюканът [15], естеството на антипролифератива в екстракта от студена и гореща вода все още не е изяснено.

Нашите резултати също показаха, че LR-CW по същество не е цитотоксичен срещу нормалните клетки на гърдата и белите дробове (184B5 и NL 20, респ.). Това е първият доклад, който демонстрира, че екстрактът от L. rhinocerus не е токсичен за нормалните клетки. Основата на селективния антипролиферативен ефект на LR-CW, който изглежда е насочен конкретно към раковите клетки, все още предстои да бъде изяснена.

За по-нататъшно изследване на природата на антипролиферативния агент в LR-CW, екстрактът се фракционира от колона за филтриране на гел Sephadex G-50 на две фракции: фракции с високо и ниско молекулно тегло. Само фракцията с високо молекулно тегло показва доста силна антипролиферативна активност срещу двете тествани ракови клетки. Фракцията с ниско молекулно тегло е лишена от антипролиферативна активност. Тъй като фракцията с високо молекулно тегло съдържа както въглехидрати, така и протеини, антипролиферативният агент може да бъде или тип протеиново-въглехидратен комплекс, и протеини, насочени към метаболитните процеси, или сигнална трансдукция в раковите клетки. Известно е, че протеини като протеази, инактивиращи протеини рибозоми и лектини могат да упражняват директни цитотоксични ефекти върху раковите клетки [2]. В ход е по-нататъшна работа за идентифициране на природата на цитотоксичния агент във високомолекулната фракция.

Смята се, че цитотоксичното действие на много противоракови агенти се медиира от апоптозата [16]. По-рано Lai et al. [7] показа, че антипролиферативният ефект на екстракта от гореща вода на P. rhinocerus срещу HL-60 клетки се медиира от спиране на клетъчните цикли при фаза G1, което води до апоптоза. Нашите проучвания на фрагментация на ДНК ясно показват, че LR-CW убива клетки MCF-7 и A549 също чрез индуциране на апоптоза. Въпреки това, агентът, индуциращ апоптоза при LR-CW, може да не е същият като този в екстракта от гореща вода на P. rhinocerus, тъй като екстрактите се различават по селективност на цитотоксичното действие (вж. По-горе).

5. Заключение

Екстрактът от студена вода от склероциите на култивирания L. rhinocerus притежава цитотоксичност срещу ракови клетки на гърдата и белия дроб, но не е токсичен за съответните нормални клетки. Неговото цитотоксично действие се дължи на фракция с високо молекулно тегло, изолирана от екстракта със студена вода и че цитотоксичното действие се медиира чрез апоптоза.

Признание

Тази работа беше финансово подкрепена от HIRGA (J-20014-73807) от Университета в Малая, Куала Лумпур, Малайзия.