РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Доминиране на вагиналната микробиота от Lactobacillus spp. е свързано със запазване на здравословен репродуктивен статус и с относително ниско pH (pH ≤ 4,5) на гениталния тракт (1). Lactobacillus spp. произвеждат метаболитни продукти, като водороден прекис (H2O2), млечна киселина и бактериоцин, за които се смята, че играят важна роля в поддържането на нормална вагинална флора чрез предотвратяване на колонизация от патогени (2, 3) В общност от приблизително 400 асимптоматични жени, тези с по-малки пропорции на лактобацили показват по-високи резултати по Nugent и стойности на pH, които се използват за диагностициране на бактериална вагиноза (4). Липсата на лактобацили във влагалищния тракт може да наруши баланса на микробната флора и може да доведе до бактериална вагиноза чрез свръхрастеж на анаеробни бактерии (5). Жените, чиято генитална микробна флора е доминирана от лактобацили, също имат по-нисък риск от заразяване с болести, предавани по полов път, като тези, причинени от вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV), вируса на херпес симплекс тип 2, човешкия папиломен вирус (HPV) и Chlamydia trachomatis (5-7 ). Освен това е доказано, че колонизацията от лактобацили е свързана с по-ниски рискове за възпалителни заболявания на таза и усложнения, свързани с бременността (1, 8).

затлъстяването

Структурата и съставът на общността Lactobacillus във вагиналната екосистема се влияят от различни фактори като възраст, менархе, менопауза, менструален цикъл, бременност, инфекции, лекарства и хигиена (9). В допълнение, затлъстяването може да бъде фактор, допринасящ за структурата и състава на бактериалната общност. Доказано е, че пълните жени имат различни физиологични характеристики, които могат да доведат до дисбиоза на гениталния тракт, включително високи нива на естроген в плазмата, системно възпаление и ниска имунна функция (10, 11). Освен това, няколко предишни проучвания показват, че индексът на телесна маса (BMI) и бременността в плазмата могат да повлияят на резултатите от бременността, като преждевременно раждане, новородени с ниско тегло, макрозомия и нарушения на раждането (12, 13). Тези акушерски и неонатални разстройства също са свързани с Lactobacillus iners - доминираща микробиота в началото на бременността и наличието на бактерии, свързани с бактериална вагиноза, както е установено чрез вагинални цитонамазки (8, 14–16). Доколкото ни е известно, досега не е провеждано изследване на връзката между затлъстяването и състава на Lactobacillus в репродуктивния тракт.

В това проучване ние оценихме връзката между затлъстяването и състава на цервикалните лактобацили при корейските жени. В предишно проучване ние извършихме пиросеквениране на 16S рРНК със 120 проби от цервикален тампон, които или показаха отрицателни резултати (n = 50), или тестваха положително за цервикална интраепителна неоплазия (CIN) (n = 70) при хистологични изследвания (17). В това проучване включихме предишните проби и 37 допълнителни тампона; след изключване на 24 проби, които показват липса на лактобацили или за които не са налични епидемиологични данни за участниците (възраст и ИТМ), имахме общо 133 проби с отрицателни резултати от CIN (n = 76) или CIN от различни степени (n = 57), въз основа на хистологични изследвания. Относителното изобилие на девет представителни Lactobacillus spp., Включително Lactobacillus crispatus, L. iners, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus psittaci, бяха използвани различни анализи за епидемични видове.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Откриване на високорискова ДНК на HPV. Цитологичните находки на шийката на матката са класифицирани според системата Bethesda (19). Детекцията на HPV ДНК се извършва с ДНК тест Digene Hybrid Capture II (Qiagen, Gaithersburg, MD, USA). Използван е хемилуминесцентен HPV ДНК тест (отбелязан в относителни светлинни единици [RLU]) със сонда, предназначена да открие 13 вида високорискови (HR) HPV. Резултатите от теста бяха разчетени като положителни при концентрации от 1 pg/ml или нива, по-големи от съотношението RLU/гранично ниво (RLU на пробата/средно RLU от 2 положителни контроли).

ДНК екстракция и анализ на пиросеквенция. Метагеномни ДНК проби бяха извлечени с помощта на екстракционен комплект FastDNA Spin (MP Biomedicals, Санта Ана, Калифорния, САЩ). Целевите фрагменти на 16S рРНК гена, съответстващи на регионите V1 до V3, се амплифицират чрез използване на баркодирани праймери. Подробна информация, включително условията за усилване и описание на процедурата за пиросеквениране, беше предоставена в предишен доклад (17). Показанията за пиросеквениране са достъпни в базата данни на EMBL Sequence Read Archive (SRA) (http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB5760).

Статистически анализ. Тестът хи-квадрат беше използван за анализ на разликите в разпределенията на категориални или общи променливи. Йерархичен клъстерен анализ, базиран на средна връзка с измервания на евклидово различие за относителното изобилие на девет Lactobacillus spp. (L. iners, L. crispatus, L. fornicalis, L. johnsonii, L. gasseri, L. jensenii, L. acidophilus, L. psittaci и некултивирани видове Lactobacillus), беше извършено с помощта на софтуер Stata 12.0 (Stata Corp., College Station, Тексас, САЩ). Нарисувана е дендрограма за йерархичен клъстерен анализ, за ​​да се покажат само топ 100 клонове, а обектите са групирани от клъстерния анализ, извършен с помощта на правила за спиране на клъстерния анализ за броя на клъстерите, определен по подразбиране (псевдо-F индекс на Calinski-Harabasz). Проста топлинна карта за относителното количество на девет Lactobacillus spp. е подготвен с помощта на софтуерен пакет R.

ИТМ са категоризирани в четири групи според азиатско-тихоокеанските стандарти, т.е. с поднормено тегло (-2), нормално тегло (18.5 до 22.9 кг м -2), наднормено тегло (23.0 до 24.9 кг м2) и затлъстяване (≥25 kg m -2) (20). Тестът на Wilcoxon за ранг-сума е използван за измерване на средната разлика в съотношенията, получени чрез разделяне на относителното изобилие на L. iners на това на L. crispatus за нонобези (BMI от −2) и затлъстяване (BMI от ≥25 kg m - 2) групи. Разпределението на съотношенията L. iners/L. crispatus и процентът на всеки вид Lactobacillus са изобразени според ИТМ или категориите на ИТМ, съответно с разпръснат график и кръгови графики. Типовете клъстер на Lactobacillus и съотношенията L. iners/L. crispatus са използвани за оценка на връзката между затлъстяването и цервикалната микрофлора на Lactobacillus. Мултивариантните коефициенти на шансове (ORs) и 95% доверителни интервали (CIs) за риска от затлъстяване са оценени чрез използване на доминиращи L. crispatus Lactobacillus клъстерни типове или група с ниско съотношение като референции. Всички променливи бяха коригирани според възрастта, менопаузалния статус, HR-HPV инфекцията и хистологичната степен като категорични променливи. Относителните количества на девет вида Lactobacillus са представени в таблица S1 в допълнителния материал.

РЕЗУЛТАТИ

Пропорции на Lactobacillus iners и L. crispatu s според индекса на телесна маса. (А) Йерархично групиране на девет вида Lactobacillu и пет вида Lactobacillus гроздове. Относителното изобилие на вида е представено от цветове (розови квадрати, големи пропорции; сини квадрати, малки пропорции). Картата на топлината включва информация за затлъстяването, възрастта и цервикалната интраепителна неоплазия (CIN). Първи ред под дендрограмата: тъмно розови кутии, затлъстяване; средно розови кутии, наднормено тегло; светлорозови кутии, нормално тегло; бели пространства, поднормено тегло. Втори ред под дендрограмата: сини кутии, възраст ≤49 години; бели пространства, възраст ≥50 години. Трети ред под дендрограмата: зелени кутии, здрави участници с отрицателни резултати от CIN; бели пространства, участници с CIN. (Б) Средни проценти на видовете в петте типа клъстер на Lactobacillus. (C) Разпръснат график на трансформираните в дневника съотношения на L. iners/L. crispatus (точкова диаграма) и средните пропорции на L. iners и L. crispatus според категориите на индекса на телесна маса (BMI) (кръгови диаграми). Стойностите на ИТМ са категоризирани в съответствие с азиатско-тихоокеанските стандарти, т.е. нормално тегло, ИТМ от 18,5 до 22,9 kg m -2; наднормено тегло, ИТМ от 23 до 24,9 kg m -2; затлъстяване, ИТМ от ≥25 kg m -2. L. uc, некултивиран вид Lactobacillus.

Пропорции на L. iners и L. crispatus според BMI. Участниците със затлъстяване са по-склонни да бъдат свързани с клъстерни типове II и IV, отколкото клъстерни тип I, въпреки че тази находка не е значима (P = 0.091, хи-квадрат тест за клъстери I, II и IV) (Фиг. 1А). Няма разлика в разпределението на младите жени (≤49 години) и по-възрастните жени (≥50 години) в основните типове клъстери (P = 0.161, тест с хи-квадрат). Всички участници в клъстер тип III са имали CIN, но не е имало разлика в разпределението на нормалните и CIN участници в основните типове клъстери (P = 0,328, хи-квадрат тест).

L. iners и L. crispatus бяха доминиращият вид сред участниците, взети в това проучване. Логарифмично трансформираното съотношение, получено чрез разделяне на относителното изобилие на L. iners на това на L. crispatus, беше изчислено при използване на 105 проби с> 1% относително изобилие на двата вида. Двадесет и осем участника бяха изключени от изчислението поради липса на изобилие от тези видове. Съотношенията L. iners/L. crispatus се различават значително между участниците с BMI 2 и тези с BMI ≥25 kg/m 2 (P L. iners и по-малки пропорции L. crispatus и по този начин имат по-високи стойности на съотношението, докато нонебез жени показаха противоречиви вариации в съотношенията (фиг. 1С, точкова диаграма) .Средният процент на L. crispatus (65,0%) е по-висок от този на L. iners (35,0%) в групата с поднормено тегло, докато средният процент на L crispatus (17,1%) е по-нисък от този на L. iners (67,4%) в групата със затлъстяване (фиг. 1В, кръгови диаграми). Средните проценти на тези лактобацили в групите с нормално тегло и с наднормено тегло са приблизително равни.

Асоциация между затлъстяването и L. iners - доминиращ тип клъстер на Lactobacillus. Затлъстяването е значително свързано с L. iners -доминантния клъстер тип (клъстер тип IV), в сравнение с L. crispatus -доминантния клъстер тип (клъстер тип I) (мултивариантно OR, 7.55 [95% CI, 1.18 до 48.2]; P = 0,033) (Таблица 1). Освен това, затлъстяването е свързано с групата с високи стойности за съотношението L. iners/L. crispatus (мултивариантно OR, 6.54 [95% CI, 1.22 до 35.1]; P = 0.022; P за тенденция = 0.022).

Асоциация между затлъстяването и Lactobacillus клъстер IV, доминиран от L. iners

Според общите характеристики на участниците в проучването разпределението на категориите ИТМ е различно при младите спрямо по-възрастните участници. Освен това в предишната си работа демонстрирахме връзката между специфичен модел на микробиома на шийката на матката и риска от CIN (17). За да се контролират ефектите от възрастта и цервикалната дисплазия върху връзката между затлъстяването и доминиращия тип клъстер на L. iners Lactobacillus, участниците в проучването са стратифицирани според възрастта (млади спрямо по-възрастни) и хистологичен резултат (нормално спрямо CIN). Затлъстяването е свързано с групата с високи стойности за съотношението L. iners/L. crispatus сред младите жени (многовариантно OR, 6,26 [95% CI, 1,15 до 33,9]; P = 0,033), но не и при възрастните жени (Таблица 2) . За нормални участници с отрицателни CIN резултати, многовариантното ИЛИ за групата с високо съотношение е 6,97 (95% CI, 1,20 до 70,4; P = 0,030). За участниците с CIN степен обаче няма значителна връзка между затлъстяването и съотношението L. iners/L. crispatus.

Асоциация между затлъстяването и съотношенията L. iners/L. crispatus

В корейско кохортно проучване с две близнаци, жените в постменопауза са имали по-малки пропорции на Lactobacillus spp., С по-голямо разнообразие (21). Затлъстяването е свързано с групата с високи стойности за съотношението L. iners/L. crispatus сред жените в пременопауза (многовариантно OR, 6,47 [95% CI, 1,46 до 28,7]; P = 0,014), но не и при жените в постменопауза (Таблица 2).

ДИСКУСИЯ

Това проучване беше първото, което демонстрира, че цервикалната микрофлора на Lactobacillus на затлъстелите жени се различава от тази на неносените жени. Затлъстяването (ИТМ от ≥25 kg/m 2) е силно свързано с цервикалния тип общност Lactobacillus, характеризиращ се с голям дял L. iners и малки пропорции на L. crispatus, L. johnsonii и L. jensenii. Тази значителна връзка между затлъстяването и доминиращия тип Lactobacillus на L. iners е установена при относително млади жени, но не е установена при по-възрастните жени. Този тип общност също е намерен за участници без CIN, но не е намерен за участници с CIN. Взети заедно, тези констатации показват, че затлъстяването е свързано с цервикален тип общност на Lactobacillus, доминиран от L. iners сред жени в репродуктивна възраст без цервикална дисплазия.

В това проучване показахме, че затлъстяването може да бъде свързано с по-високо съотношение L. iners/L. crispatus за цервикалния микробиом, въпреки че 28 жени бяха изключени поради липса на относителни стойности на изобилие за двата вида. L. crispatus и L. iners са доминиращи видове в цервикалните микробиоми на азиатските жени, включително участниците в нашето проучване. Преобладаването на L. crispatus е показано при надлъжен анализ, за ​​да се насърчи стабилността на вагиналната микробиота (22). Нови доказателства обаче показват, че тези два вида се различават по своите екологични функции в репродуктивния тракт (23). Водородният пероксид, антимикробно съединение, се произвежда от 95% от изолатите на L. crispatus и 94% от изолатите на L. jensenii, но само от 9% от изолатите на L. iners (описано като L. 1086V от Антонио и др. [1]). d -Млечната киселина е по-висока при жените, чиято вагинална флора е доминирана от L. crispatus, отколкото при тези, чиято флора е доминирана от L. iners или Gardnerella. L. crispatus и L. gasseri съдържат едно или две копия както на l-, така и на d-лактат дехидрогеназите, докато генът, кодиращ d-лактат дехидрогеназата, липсва в генома на L. iners UPII 60-B (16).

Причината, поради която затлъстелите жени имат по-големи пропорции на L. iners в техните цервикални микрофлори, е неясна. L. iners е доминиращият вид във вагиналната флора, когато флората е в преходен стадий между нормална и ненормална, или поради лечение с антибиотици, или поради физиологични промени като по-високи плазмени нива на естрадиол (24). Естрогенът може да бъде най-вероятният фактор, допринасящ за преобладаването на L. iners при затлъстелите жени от това проучване. Циркулиращите нива на естрадиол са силно свързани с затлъстяването (25) и ефектите от наднорменото тегло или затлъстяването върху риска от рак на гърдата и ендометриума са до голяма степен медиирани от този физиологичен фактор (10). Въпреки че нивата на естроген на участниците в нашето проучване не са измерени, възможността за принос на естроген към тази асоциация остава.

Наскоро доказателства от проучвания върху животни показват, че съставът на чревната флора се различава между индивидите със затлъстяване и индивидите с нормално тегло (26). Различията в бактериалното разнообразие на стомашно-чревния тракт, както в състава, така и в количеството, са свързани със затлъстяването, сърдечно-съдовите заболявания, метаболитния синдром и захарен диабет тип 2 (26). Едно проучване, изследващо транссексуални жени от мъже към жени, показва, че 79,5% от жените едновременно са имали едни и същи лактобацили както в неовагината, така и в ректума (27). Този резултат предполага, че ректумът може да бъде свързан с колонизацията на вагинални видове Lactobacillus. По този начин чревните микробиоми на затлъстелите жени могат да имат ефект върху състава на техните цервиковагинални микробиоми.

Връзката между затлъстяването и цервикалния тип Lactobacillus, доминиран от L. iners, се наблюдава при сравнително млади жени в репродуктивна възраст, но не и при по-възрастни жени. Lee et al. съобщава, че съставът или разнообразието на вагиналната микробиота е повлияно от генетични или физиологични фактори, като менопауза и нива на естроген, при корейските жени (21). В допълнение, връзката между затлъстяването и доминиращата микрофлора на Lactobacillus на L. iners е установена само при нормални участници и не е открита при участници с CIN. Въпреки че лактобацилите значително допринасят за поддържането на нормалната вагинална флора, е много вероятно други патогени да бъдат свързани с анормален клетъчен растеж. Няколко проучвания, включително предишната ни работа, съобщават за значителна корелация между бактериалната вагиноза или дела на анаеробните бактерии, свързани с бактериалната вагиноза, и CIN (17, 36, 37). Взети заедно, връзката между затлъстяването и цервикалната микрофлора на Lactobacillus, доминирана от L. iners, не засяга цервикалната дисплазия, но е вероятно да бъде установена при жени в репродуктивна възраст и може да повлияе на акушерските и неонатални усложнения, свързани със затлъстяването при тези жени.

Нашето проучване има няколко ограничения. Изследванията в напречно сечение са ограничени от факта, че те се извършват в един момент от времето и не дават индикация за последователността на събитията, т.е. дали експозицията е настъпила преди, след или по време на началото на резултата от заболяването (38). Следователно е невъзможно да се направи извод за причинно-следствената връзка между затлъстяването и типа Lactobacillus, доминиран от L. iners в това проучване. Малкият размер на извадката от това проучване ограничава оценката на връзката и води до широк 95% доверителен интервал. Различни фактори, които влияят на вагиналната флора на Lactobacillus, като менструален цикъл, нива на естрадиол и нива на С-реактивен протеин, не са оценени едновременно. Мащабно проучване, което разглежда различни потенциални фактори, ще бъде важно за възпроизвеждане и за потвърждаване на нашите констатации.

В заключение, резултатите от това проучване показват, че затлъстяването е свързано с цервикална микрофлора на Lactobacillus, доминирана от L. iners при жени в репродуктивна възраст. Предполагаме, че затлъстяването може да насърчи преобладаването на L. iners в цервиковагиналната екосистема и че това състояние може да увеличи риска от акушерски и неонатални усложнения, свързани със затлъстяването, като преждевременно раждане, при корейски жени в репродуктивна възраст. Необходими са повече доказателства, за да се разкрие причинно-следствената връзка между затлъстяването и състава на микробиотата и да се обясни ролята на цервиковагиналната микробиота в поддържането на здрав репродуктивен тракт.

ПРИЗНАВАНИЯ

Тази работа беше подкрепена с безвъзмездни средства от Корейския национален център за борба с рака (безвъзмездни средства 1110320 и 1310360).