Д-р Руй Уанг-Сатлър

затлъстяване

Институт по молекулярна епидемиология

Helmholtz Zentrum München, Немски изследователски център за здраве на околната среда

Ingolstädter Landstraße 1, 85764 Neuherberg (Германия)

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Разпространението на детското затлъстяване нараства драстично в световен мащаб през последните три десетилетия [1]. Основната причина е сложното взаимодействие между предразполагащите генетични фактори и промяната на факторите на околната среда, като хранителни навици [2, 3]. Тази тенденция предизвиква голяма загриженост, като се имат предвид многобройните последици от затлъстяването върху здравето на децата. Те включват метаболитни нарушения като инсулинова резистентност, дислипидемия и хипертония, които от своя страна насърчават развитието на сърдечно-съдови заболявания в детска възраст, както и в по-късен живот [2, 4] .

За разработването на подходящи стратегии за лечение е неизбежно доброто разбиране на свързаните със затлъстяването патофизиологични механизми. През последните години бяха разработени усъвършенствани лабораторни техники и инструменти за обработка на данни, позволяващи едновременно мащабно изследване на голям брой метаболити в човешки биофлуиди или тъкани [5–7]. Профилът на човешкия серумен метаболит отразява метаболитните процеси, включително свързаните с болестта промени [8]. Следователно, изследването на серумните концентрации на метаболити при деца със затлъстяване може да даде нови прозрения за биологичния механизъм, свързан с детското затлъстяване. Малко проучвания вече са изследвали свързаните със затлъстяването промени в серумния метаболом при възрастни [9–12] и юноши [13] .

В настоящото проучване ние приложихме целенасочен метаболомичен подход за идентифициране на серумни метаболити, свързани с детското затлъстяване. Основните цели на това проучване бяха i) да се изследва дали профилът на концентрация на серумните метаболити се различава при деца със затлъстяване и деца с нормално тегло, ii) да се идентифицират потенциалните биомаркери, свързани с наднорменото тегло, и iii) да се анализира връзката на пубертета с метаболитен профил.

Материали и методи

Проучете населението и антропометричните мерки

През годините 2008–2009 г. бяха изследвани 80 деца и юноши със затлъстяване на възраст 6–15 години от амбулаторията за затлъстяване в Vestische Kinder- und Jugendklinik Datteln, Германия, и 40 деца с нормално тегло с подобна възраст и разпределение по пол. Всички деца са родени в Германия. Децата със синдромно затлъстяване, както и психиатрични или ендокринни разстройства, включително захарен диабет тип 2, бяха изключени. Комитетът по етика на университета във Витен/Хердеке одобри това проучване. Получено е писмено информирано съгласие от всички субекти и техните родители.

Височината беше измерена с точност до сантиметър с помощта на твърд стадиометър. Несъблеченото тегло беше измерено с точност до 0,1 kg с помощта на калибрирана везна. Затлъстяването се определя като ИТМ над 97-ия процентил от германските специфични данни за населението [14]. Всички затлъстели деца отговарят на критериите за затлъстяване на Международната работна група за затлъстяване, като са над специфичния за населението, възрастта и пола процентил, превеждащ се до ИТМ от 30 kg/m 2 на възраст 18 години [15]. ИТМ процентилите и резултатите със стандартно отклонение (SDS-BMI) бяха изчислени въз основа на метода на Cole’s LMS [16]. Пуберталната фаза е оценена според Marshall and Tanner [17,18] и е категоризирана в три етапа на базата на срамната коса и гениталните етапи: препубертатна = момчета/момичета с пубисна коса I етап и гонадална/гръдна фаза I, пубертална = момчета/момичета с фаза на срамната коса ≥ II и стадия на гонадите/гърдите ≥ II и късна/постпубертална = момчета със смяна на гласа и момичета с менархе.

Вземане на проби и измерване на метаболит

Взети са кръвни проби в 8 часа сутринта след нощно гладуване в продължение на поне 10 часа. След коагулация при стайна температура, кръвните проби се центрофугират в продължение на 10 минути при 8000 rpm. Аликвотирани серумни проби се съхраняват при –80 ° C и се размразяват при стайна температура за метаболомичния анализ.

Използвахме метаболомиката AbsoluteIDQ™ комплект p150 (Biocrates Life Sciences AG, Инсбрук, Австрия) за количествено определяне на 163 метаболита, следвайки инструкциите, описани в ръководството на производителя. Работата с течности на серумни проби се извършва с робот Hamilton Micro Lab Star (Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Швейцария). Пробите бяха анализирани на система API4000 LC/MS/MS (AB Sciex Deutschland GmbH, Дармщат, Германия), оборудвана с HTC PAL автосамплер (CTC Analytics, Цвинген, Швейцария) и източник на електроспрей йонизация (ESI), който беше използван и при двете и отрицателен режим. MS/MS анализът се изпълнява в режим на мониторинг на множество реакции (MRM). Целият аналитичен процес се контролира от софтуера Analyst 1.4 и софтуерния пакет MetIQ ™, като последният е неразделна част от AbsoluteIDQ комплект. Концентрациите на метаболит се определят със софтуера MetIQ.

Измерванията се провеждаха в две отделни партиди. За оценка на качеството на данните, 43 от пробите от първата партида бяха премерени във втората. Също така, референтна проба беше измерена пет пъти за всяка от двете партиди. Изключихме метаболитите от анализа, които не отговаряха на два или повече от следните критерии за качество:

i) Концентрацията на метаболита трябва да бъде над границата на откриване (LOD), определена от производителя, в поне 60% от пробите.

ii) Коефициентът на корелация на Pearson на концентрациите на метаболита в 43 многократно измерени проби трябва да бъде най-малко 0,5 между двете партиди.

iii) За всяка партида коефициентът на вариация (CV) за концентрацията на метаболита в референтните проби не трябва да бъде по-висок от 0,2.

Общо 130 метаболита са преминали контрола на качеството. Повечето от 33-те изключени метаболити се характеризират с концентрации под или незначително над LOD. В резултат на това стабилността на измерванията е била засегната в тези случаи. В съответствие с инструкцията за комплекта всички измервания са умножени по специфичен за метаболита и партидата корекционен фактор, за да се коригира допълнително за потенциален партиден ефект.

Спектърът на метаболитите, насочен към използвания комплект, е показан в допълнителна таблица 1 (вж. Допълнителен материал). 130-те метаболита, включени в нашия анализ, включват 24 конюгирани карнитина (ацилкарнитини (Cx: y), хидроксилацилкарнитини (C (OH) x: y) и дикарбоксилацилкарнитини (Cx: y-DC), свободен карнитин (C0), 14 аминокиселини, хексоза (H1), 32 диацил фосфатидилхолини (PC aa Cx: y), 35 ацил-алкил фосфатидилхолини (PC ae Cx: y), 9 лизофосфатидилхолини (LPC a Cx: y), както и 14 сфингомиелини (SM Cx: y) и хидроксисфингомиелини (SM (OH) Cx: y), където Cx: y съкращава състава на липидната странична верига, x и y, обозначаващ съответно броя на въглеродните и двойните връзки. За отбелязване е, че приложената тук аналитична техника не е в състояние определяне на точното положение на двойните връзки и - в случая на PC - разпределението на въглеродните атоми между двете странични вериги на мастните киселини. Ние отчитаме всички концентрации на метаболити в µmol/l. По-нататък ние отнасяме концентрациите на метаболитите просто като метаболити и съотношения на концентрация на метаболит като съотношения на метаболитите.

Статистически анализ

Всички изчисления са извършени в статистическата среда R, версия 2.10.1 [19]. Антропометричните характеристики на децата със затлъстяване и деца с нормално тегло бяха сравнени с помощта на тестове на Wilcoxon с ранг и Chi-square на Пиърсън.

За да се изследва степента, в която се разделят профилите на серумния метаболит на деца със затлъстяване и с нормално тегло и на деца от различни стадии на пубертета, е извършен анализ на частични най-малки квадрати (PLS) с 10-кратна кръстосана валидация върху мащабираната и центрирана матрица на метаболитни концентрации с помощта на R пакет pls [20]. Данните бяха визуализирани чрез нанасяне на кръстосано валидираните резултати от първите два компонента в графика с деления, където всяка точка представлява индивидуална серумна проба.

За да определим дали концентрациите на единичен метаболит се различават при деца със затлъстяване и нормално тегло, направихме логистични регресионни анализи със статус на теглото (затлъстяване спрямо нормално тегло) като зависима променлива и естествения логаритъм на концентрациите на единичен метаболит и ковариатите възраст, пол и пубертетен стадий като независими променливи. Подобен анализ беше извършен за изследване на връзките между пубертетен стадий (препубертален спрямо пубертален/постпубертален) и концентрации на метаболити, коригирани за възрастта и пола и само за секса.

В следваща стъпка повторихме анализа за затлъстяване със съотношения на всички възможни двойки метаболити, позволявайки откриването на разлики между деца със затлъстяване и деца с нормално тегло, които иначе са маскирани от голяма вътрешногрупова променливост в концентрациите на единичен метаболит [ 21,22]. В допълнение, промените в съотношенията на метаболитите могат да отразяват биологични ситуации като промени в ензимната активност или дисбаланси в метаболитните пътища. За всички регресионни анализи ние разгледахме експериментална грешка от тип I от 0,05 като статистически значима. Корекцията за многократно тестване, използваща корекцията на Bonferroni, доведе до ниво на значимост p = 0,05/130 = 3,8 × 10 –4 и p = 0,05/8 385 = 6,0 × 10 –6, съответно за единични метаболити и метаболити. В случай на съотношения на метаболитите, ние изчислихме p-печалбата, дефинирана като минимум от двете p-стойности за анализите на единичен метаболит, разделени на p-стойността за съотношението на метаболитите [21]. Колкото по-висок е коефициентът на р за съотношението на метаболитите, толкова по-ниска стойност на р за съотношението на метаболитите се дължи на промяна в съотношението, а не на силна промяна само на един от единичните метаболити. В това проучване се фокусирахме върху съотношенията на метаболитите с p коефициент на въздействие най-малко 1,0 × 10 3 .

Резултати

Характеристики на изследваното население

Антропометричните характеристики на децата са представени в таблица 1. Децата с наднормено тегло и с нормално тегло не се различават значително по отношение на пол, възраст и разпределение в пубертета. По дизайн телесното тегло, ИТМ и SDS-BMI са били значително по-високи в групата на затлъстелите деца (p –6) и прилагане на граница на p-усилване при ≥ 1,0 × 10 3 (допълнителна таблица 3; вж. Допълнителния материал). Резултатите за избрани представителни съотношения са показани в таблица 3. Съотношенията между наситени и ненаситени LPC, между наситени LPC и PC и между SM и PC са увеличени при затлъстели в сравнение с деца с нормално тегло. Като пример съотношението на шансовете за това, че сте в групата със затлъстяване на LPC a C18: 0/LPC a C20: 4, е 8.4 (4.1, 20.1) със стойност на ap 1.1 × 10 –7 и печалба на ap 1.1 × 10 3 .

Таблица 3

Избор на съотношения на концентрация на метаболит, които се различават значително между деца с нормално тегло и затлъстяване

Дискусия

Това проучване сравнява концентрациите на серумни метаболити при деца със затлъстяване и с нормално тегло при систематичен метаболомичен подход. 14 метаболита и 69 метаболитни съотношения са значително различни при затлъстели в сравнение с деца с нормално тегло.

Промени в метаболита, свързани със затлъстяването

Установихме значително намалена концентрация на глутамин, метионин и пролин при затлъстели в сравнение с деца с нормално тегло. По този начин възпроизведохме констатациите от по-ранно проучване, съобщаващо за намалени нива на метионин и пролин при деца с изключително затлъстяване [28]. Доколкото ни е известно, нито едно проучване върху деца със затлъстяване не е показало намаляване на глутамина. Откритията на други изследвания обаче сочат към свързано със затлъстяването активиране на пътя на хексозамин [29,30,31]. Известно е, че глюкозаминът и хексозамините допринасят за развитието на инсулинова резистентност [29,32]. В допълнение, активирането на хексозаминовия път намалява енергийните разходи [30].

Нашето проучване потвърди, че концентрациите на ацил-алкил PC са значително по-ниски при затлъстяване [10]. Подклас на ацил-алкилни PC са така наречените плазмологени, които имат антиоксидантни свойства [33]. Наблюдаваното намаляване на ацил-алкиловите компютри при затлъстели деца може да отразява консумацията на плазмалогени по време на оксидативен стрес, за който е известно, че играе роля при детското затлъстяване [34].

Наблюдавахме значително повишено съотношение между наситени LPC (C16: 0, C18: 0) и PC при затлъстели деца. Концентрациите на наситени LPC също бяха леко увеличени. LPC се получават от PC по време на LDL окисление чрез лецитин-холестерол ацилтрансферазата (LCAT) или свързаната с липопротеините фосфолипаза А2 (LpPLA2) път [35]. В действителност се съобщава за повишена активност на LpPLA2 при деца със затлъстяване [36]. Като основен компонент на окисления LDL, наситените LPC имат проатерогенен и провъзпалителен ефект и влошават инсулиновата сигнализация [35,37].

Децата с наднормено тегло демонстрират значително намалени концентрации на ненаситените LPCs C18: 1, C18: 2 и C20: 4. Освен това съотношенията между наситени и ненаситени LPC бяха значително увеличени. Нашите открития са в съответствие с неотдавнашно проучване на метаболомиката при мъже с наднормено тегло/затлъстяване и нормално тегло, показващо значително намалени концентрации на LPC C18: 1 и повишени концентрации на LPC C18: 0, заедно с намалено съотношение на диетичен прием на полиненаситени към наситени мастни киселини [ 12]. Възникващото предположение, че съставът на мастните киселини на серумните (лизо-) фосфолипиди отразява отчасти средносрочния прием на мастни киселини в храната на индивида, се подкрепя от съобщените корелации между диетичните и плазмените фосфолипидни мастни киселини [38,39]. Засега има малко доказателства за ролята на специфични диетични характеристики, включително баланса на мастните киселини, при детския риск от затлъстяване [40].

Нашето наблюдение, че съотношенията SM/PC са значително увеличени при деца със затлъстяване, може да отразява повишена скорост на реакцията на сфингомиелин синтаза (SMS) [41]. Не наблюдавахме значително увеличение на единичните концентрации на SM. Това може да изобрази равновесието на синтеза и метаболизма на SM. Синтезираните SM незабавно подлежат на хидролиза чрез сфингомиелиназа (SMase), като се получават керамиди, за които е доказано, че играят роля в развитието на инсулинова резистентност и сърдечно-съдови нарушения [42,43].

Субанализа на пубертетен етап

В нашето проучване пубертетният стадий не е свързан със серумни концентрации на метаболити. Доколкото ни е известно, няма публикувани проучвания, които да изследват връзката между метаболитите и пубертета по подобен начин, което затруднява директното сравнение с нашите резултати. Както напречното сечение, така и надлъжните изследвания на пубертетен стадий показват намаляване на чувствителността към инсулин по време на пубертетно развитие, което е придружено от повишено окисление на мастните киселини [51,52]. Освен това се съобщава за намалена протеолиза и окисление на протеини по време на пубертета в сравнение с предпубертета [53]. Фактът, че не сме наблюдавали промени в серумната концентрация на ацилкарнитин или аминокиселини, свързани с пубертета, може да показва, че тези промени се случват във физиологичен и компенсируем диапазон или не са уловени от метаболитния панел, насочен в това проучване.

Сравнение с проучвания при възрастни

Данните от възрастни и деца са трудни за сравнение, тъй като растежът може да окаже влияние върху метаболизма. И все пак е интересно да се види, че има последователност, както и несъответствие по отношение на метаболомичните промени, свързани със затлъстяването. Нашите открития за свързаните със затлъстяването промени в концентрациите на ацилкарнитин, ацил-алкил PC, LPC и SM са до голяма степен в съответствие с по-ранни проучвания при възрастни [9,10,12,44,45]. За разлика от това, резултатите относно концентрациите на аминокиселини в нашето проучване на деца със затлъстяване се отклоняват от констатациите при възрастни. Например, аминокиселините с разклонена верига (BCAA) и свързаните с тях метаболити са постоянно установявани при затлъстяване в сравнение с слаби възрастни [11,12,46,47,48], докато ние, както и Mihalik et al. [13] не са наблюдавали същото при деца. При възрастни един от предложените механизми за повишените нива на BCAA при лица със затлъстяване и резистентност към инсулин е намаленото окисление на BCAA в мастната тъкан [49,50]. Аргументирайки се в съответствие с Mihalik et al. [13], децата могат да проявят ранни адаптивни механизми, запазващи нормален метаболизъм на BCAA при наличие на затлъстяване и нарушена инсулинова чувствителност.

Силни страни и ограничения

Нашето проучване има някои потенциални ограничения. Размерът на извадката беше само умерен, така че проучването беше недостатъчно мощно за откриване на по-малки ефекти. Освен това, като изследване в напречно сечение, то не ни позволява да заключим причинно-следствената връзка от наблюдаваните разлики между тегловните групи. В тази връзка, надлъжните и интервенционните проучвания могат да дадат допълнителна информация. Освен това ни липсва информация относно диетата и физическата активност на децата. Въпреки това, за разлика от използването на въпросници, които имат много висока грешка при измерване, концентрациите на серумни метаболити са вероятно по-надеждни заместители за хранителен прием.

Силна страна на нашето проучване е, че ние прилагаме систематичен метаболомичен подход за сравняване на серумния метаболом на затлъстелите деца с този на децата с нормално тегло. Освен това, изследването на метаболомиката при деца може да доведе до по-големи и по-специално „истински“ ефекти, отколкото при възрастни, тъй като децата обикновено не страдат от други заболявания, не приемат лекарства или пушат - фактори, които биха могли да повлияят на профила на концентрация на метаболитите [5].

В заключение, нашите данни предоставят доказателства за свързани със затлъстяването промени в профила на серумния метаболит при деца. Ако се повторят в по-големи проучвания, идентифицираните метаболити и съотношенията на метаболитите могат да се разглеждат като потенциални биомаркери при генерирането на нови хипотези за патофизиологични процеси, свързани със затлъстяването.

Благодарности

Ние искрено благодарим на участниците в проучването, както и на техните родители. Благодарни сме на Петра Никловиц за провеждането на биохимичните измервания. Благодарим на Джулия Скарпа, Катарина Скел и Арсин Сабунчи за измерванията на метаболомиката, извършени в Helmholtz Zentrum München, Център за анализ на генома, Основно съоръжение за метаболомика. Освен това благодарим на Anja Kleinschmidt, Janina Ried и Ann-Kristin Petersen за коментари, дискусии и предложения.

Финансиране

Тази работа беше подкрепена от следните безвъзмездни средства от германското федерално министерство на образованието и научните изследвания (BMBF): номер на субсидия 01GS0820 на Националната мрежа за изследване на генома, NGFNplus, номер на субсидия 01 GI0839 на мрежата за затлъстяване затлъстяване (LARGE), безвъзмездна помощ FKZ 0315494A на проекта за системна биология на метаботипи, SysMBo, и предоставете номер 03IS206IB на проекта Gani Med на WRM и на Германския център за изследване на диабета (DZD eV). Освен това беше подкрепено с финансиране от университета във Витен/Хердеке и от Helmholtz Zentrum München. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Декларация за оповестяване

Всички автори заявяват, че няма конфликт на интереси.