Резюме

Информация за финансиране Институт за изследване на здравето на храносмилателната система на семейството Farncombe (KMK); Канадски институт за здравни изследвания (CJB); Канада Програма за научни столове (MGS, DMS); Съвет по природни науки и инженерни изследвания на Канада, Геном Канада (PBM).

диетата

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Затлъстяването при майката и излишното гестационно наддаване на тегло са ключови предиктори за затлъстяване при деца и метаболитни усложнения в зряла възраст. Връзката между затлъстяването при майките и потомството е широко изследвана както в клинични, така и в експериментални условия (Gluckman and Hanson, 2007). Излишният прием на наситени мазнини и затлъстяването са свързани с повишен риск от усложнения при бременност, включително прееклампсия (Triunfo и Lanzone, 2014), и може да доведе до свръхрастеж на плода и промяна в развитието на плацентата (Wallace et al., 2012). Въпреки че проучванията при животни показват, че затлъстяването, предизвикано от майката с високо съдържание на мазнини (HFD), е силно свързано с метаболитно заболяване на потомството (Morris and Chen, 2009; Howie et al., 2009; Elahi et al., 2009), сигналните пътища, по които майките Приемът на HFD, затлъстяването или излишното гестационно наддаване на тегло може да доведе до метаболитна дисфункция на потомството, все още са неясни.

Връзката между чревните микроби и метаболизма на гостоприемника се превърна в един от най-изследваните фактори, медииращи риска от затлъстяване (Holmes et al., 2012), и е доказано, че бременността променя изобилието и вида на бактериите, които колонизират червата (Koren et al., 2012). Предполага се, че тези промени допринасят за метаболитните адаптации на майката към бременността и могат да медиират резултатите от бременността (Koren et al., 2012; Goltsman et al., 2018). Ние и други показахме, че тези бактериални промени се модифицират допълнително от HFD на майката и затлъстяването (Collado et al., 2008; Santacruz et al., 2010; Gohir et al., 2015), но сигналните молекули, които отнасят микробното изобилие на възпалителни и метаболитни реакции по време на бременност не са проучени задълбочено. Последните данни показват, че майчиният пропионат е отрицателно свързан с майчиния лептин и измерванията на теглото на бебето (Priyadarshini et al., 2014) и предполагат, че промени в микробиотата на бременните черва могат да повлияят на метаболизма чрез промени в производството на мастни киселини с къса верига (SCFA). SCFA влияят върху функцията на чревната бариера (Burger-van Paassen et al., 2009). Промените в чревната микробиота на мъжки мишки с високо съдържание на мазнини са свързани с повишен циркулиращ бактериален липополизахарид (LPS), предизвикващ метаболитна ендотоксемия (Cani et al., 2008). В контекста на бременността, метаболитната ендотоксемия на майката може да допринесе за възпаление на плацентата в резултат на HFD на майката и затлъстяване (Li et al., 2013; Pantham et al., 2015; Salati et al., 2018).

В това проучване имахме за цел да определим влиянието на приема на HFD преди и по време на бременността върху чревната микробиота на майката и нейната връзка с чревното възпаление и целостта на бариерата, и допълнително да проучим дали ендотоксемията на майката е свързана с метаболитен стрес и възпаление на плацентата и нарушен фетален развитие на червата.

2 МЕТОДА

2.1 Одобрение на етиката

Всички процедури за животни за това проучване са одобрени от Етичния съвет за изследване на животните на Университета Макмастър (Протокол за използване на животните 12-10-38) в съответствие с насоките на Канадския съвет за грижа за животните и етичните принципи на това списание (Grundy, 2015).

2.2 Животински модел

2.3 Профилиране на майчината микробиота

ДНК екстракция и 16S rRNA генно секвениране

Геномна ДНК беше извлечена от фекални проби, както беше описано по-рано (Whelan et al., 2014) с някои модификации: бяха използвани 0,2 g фекален материал и беше включен допълнителен етап на механичен лизис, използвайки 0,2 g 2,8 mm керамични мъниста. PCR амплификация на променливия3 (V3) регион на гена 16S rRNA впоследствие беше извършена върху извлечената ДНК от всяка проба независимо, използвайки методи, описани по-рано (Bartram et al., 2011; Whelan et al., 2014). Всяка реакция съдържа 5pmol праймер, 200 mmol dNTPs, 1.5μl50mM MgCl2,2μl от 10 mg/ml говежди серумен албумин (облъчен с трансилуминатор за премахване на замърсяващата ДНК) и 0.25μl Taq полимераза (Life Technologies, Канада) за обща реакция обем от 50μl. Праймерите 341F и 518R бяха модифицирани, за да включат адаптерни последователности, специфични за технологията Illumina, и бяха използвани баркодове с двойки от 6 основи, за да се позволи мултиплексиране на проби, както е описано по-горе. 16S ДНК продукти на PCR амплификацията впоследствие бяха секвенирани с помощта на платформата Illumina MiSeq (2 × 150bp) в Farncombe Genomics Facility (McMaster University, Hamilton ON, Canada).

Обработка и анализ на последователността

Получените FASTQ файлове бяха обработени с помощта на собствен вътрешен конвейер, както беше описано по-рано (Whelan et al., 2014). Накратко, отчитанията, надвишаващи дължината на 16S рРНК V3 региона, бяха изрязани (cutadapt, RRID: SCR_011841), сдвоените четения бяха подравнени (PANDAseq, RRID: SCR_002705), оперативните таксономични единици (OTU) бяха групирани въз основа на 97% сходство ( ИзобиленOTU +, SCR_016527). На таксономията е присвоен класификатор RDP (проект за база данни на рибозома, RRID: SCR_006633) срещу издаването на референтната база данни на Greengenes на 4 февруари 2011 г. (Greengenes, RRID: SCR_002830). Всички OTU, които не са присвоени на бактериалния домейн, се отстраняват, както и всеки OTU, на който е присвоена само 1 последователност. Тази обработка доведе до общо 11 027 452 четения (средно 137 843 четения на проба; диапазон: 59 233-249 890) и 9237 OTU.

Таксономични обобщения са създадени с помощта на количествени прозрения в микробната екология (QIIME; RRID: SCR_008249). Мерките за бета разнообразие бяха изчислени с помощта на метриката на различието на Bray Curtis (phyloseq, RRID: SCR_013080) в R (R Project for Statistical Computing, RRID: SCR_001905) и тествани за различия в цели общности между групи, използвайки пермутационен мултивариатен анализ на дисперсията (PERMANOVA) в командата adonis (веган, RRID: SCR_011950). Тези резултати бяха визуализирани чрез ръководен координационен анализ (PCoA) (ggplot2, RRID: SCR_014601). Родове, които се различават значително между групите (след корекция α = 0,01), са изчислени с помощта на процедурата за многократно тестване на Benjamini-Hochberg (DESeq2, RRID: SCR_015687).

2.4 Количествено определяне на чревните мастни киселини на майката

Нивата на SCFA бяха измерени в проби от цекула на майката от Регионалния център за масова спектрометрия на McMaster (MR-CMS). Еквивалентно тегло количество от 3,7% HCI, 10 μl10 ul вътрешен стандарт и 500 μl диетилов етер се добавя към всяка проба от цекали и се завихря за 15 минути. След завихряне 400 μl диетилов етер фекален екстракт се прехвърля в чиста епруветка Eppendorf от 1,5 ml. В хроматографски флакон, съдържащ вложка, се добавят 20 μl N-трет-бутилдиметилсилил-N-метилтрифлуороацетамид (MTBSTFA), след което се добавят 60 μl диетилов етер фекален екстракт. Сместа се инкубира при стайна температура в продължение на 1 час и се анализира с помощта на GC-MS (Agilent 6890N GC, свързан с Agilent 5973N Mass Selective Detector).

2.5 РНК екстракция и синтез на кДНК

2.6 Количествена PCR

2.7 NF.kB активност и анализи на Western Blot

2.8 Целостта на чревната бариера на майката

В отделна кохорта от мишки се използва анализ на флуоресцеин изотиоцианат-декстран (FITC-декстран) за измерване in vivo чревна пропускливост за оценка на целостта на чревната бариера на майката преди и по време на бременността. Както при небременни, така и при бременни (Е18.5) мишки се взема кръвна проба на изходно ниво чрез кървене от опашната вена. Плазмата се изолира и съхранява при 4 ° С, защитена от пряка светлина до анализ. На всяка мишка се прилага ‥ μl от 80 mg/ml белязан с FITC декстран (молекулна маса 4kDa; Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) чрез орален сондаж. След 4 часа, втора кръвна проба след сонда се събира чрез кръвоизлив от вената и се изолира плазма. Интензивността на флуоресценция на плазмата беше измерена на плоча за четене (BioTek ®, Oakville, Канада) с емисия 530 nM и възбуждане при 485 nM. Целостта на чревната бариера се определя количествено чрез изваждане на базовите стойности на флуоресценция от стойностите на флуоресценция след измерване във всеки язовир и се изразява като относителни флуоресцентни единици (RFU).

2.9 Биохимични анализи

Вътрешен колориметричен репортерен биологичен тест е използван за количествено определяне на активирането на NF-κB от рецептора за разпознаване на модели TLR-4 в отговор на LPS (Verschoor et al., 2015). Накратко, генерирана е LPS-реагираща репортерска клетъчна линия чрез временна трансфекция на плазмида pNifty2-SEAP в търговска налична клетъчна линия HEK293 (RRID: CVCL_Y406), експресираща TLR4, MD2 и CD14 (Invivogen, CA, USA). Клетките се засяват при 4 х 10 3 на гнездо в 96-гнездова плака в Complete DMEM за 24 часа. Серумните проби се разреждат 1: 5 във фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS), след това 1: 1 в стерилна вода и се загряват при 75 ° С за 5 минути. Пълната DMEM среда беше отстранена преди добавянето на топлинно инактивирана плазма в среда за HEK Blue Detection (HBD) (Invivogen, Калифорния, САЩ); 10 μl проба и 190 μl HBD среда бяха добавени в подходящите ямки. Отчитанията се извършват при 630 nm, 72 часа след стимулация, и фоновите нива се изваждат от относителните единици на абсорбция. Стандартните криви, генерирани с помощта на различни дози пречистен LPS, бяха използвани за изчисляване на относителното количество LPS в серума.

TNF и IL-6

Нивата на TNF и IL-6 в серума на майката са измерени с помощта на панел с магнитни зърна на мишки Milliplex Map Mouse (EMB Millipore, MCYTOMAG-70K, Дармщат, Германия), който използва метода за откриване Luminex xMAP. Протоколът беше спазен съгласно инструкциите на производителя.

2.10 Имунохистохимия

2.11 Надеждност

В подгрупа от проби от плацента е използван персонализиран nCounter Reporter CodeSet, проектиран от д-р Аск (Университет Макмастър), за да се анализира плацентарната генна експресия с помощта на NanoString nCounter генна експресионна система (Таблица 3). Накратко, 100 ng от общата РНК се инкубират за една нощ при 65 ° С с nCounter Reporter CodeSet, Capture ProbeSet и буфер за хибридизация. След хибридизация, пробите бяха обработени с помощта на nCounter Prep-станция и nSolver Analysis Software 2.5 беше използван за нормализиране на сурови NanoString данни на 6 домакини: UBC, TUBA1A, HPRT, IPO8, GusB и β-актин.