Микробна физиология и метаболизъм

Редактиран от
Даниела Де Биасе

Университет Сапиенца в Рим, Италия

Прегледан от
Донг-Ву Лий

Университет Йонсей, Южна Корея

Карстен Сандърс

Университет Kutztown в Пенсилвания, САЩ

Франсоа-Пиер Мартин

Институт по здравни науки на Nestle (NIHS), Швейцария

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

предизвиква

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Департамент по медицина, Университет на Монреал, Монреал, Квебек, Канада
  • 2 Лаборатория за хранене и микробиоми, Институт за рак на Монреал, Център за научни изследвания към Център за болница на Университета на Монреал, Монреал, Квебек, Канада

Въведение

Наличността на хранителни вещества в червата е основен двигател на структурата на микробната общност (Kamada et al., 2013). Едно такова хранително вещество е желязото. В червата бактериалната преживяемост силно зависи от способността им да улавят желязо (Weinberg, 2009). За много бактериални патогени желязото често е ограничаващ фактор за колонизация и инфекция (Becker and Skaar, 2014). Бактериалните стратегии за управление на желязото, включително механизмите за усвояване на желязо, могат да заемат голяма част от генома на бактериите (Andrews et al., 2003). Бактериалните системи за придобиване на желязо включват директен контакт между бактерията и екзогенните източници на желязо, както и по-сложни системи, които разчитат на молекули, синтезирани и освободени от бактериите в извънклетъчната среда, за да изчистят желязото или хема от различни източници. Те включват високоафинитетни системи за придобиване на желязо-сидерофор и хем, които позволяват на бактериите да се конкурират за желязо (Wandersman and Delepelaire, 2004). Като такъв, наличността на чревно луминално желязо е силно зависима от диетичните компоненти и/или добавките с желязо и има потенциала да повлияе пряко на микробния състав.

По-рано показахме, че при мишки желязото диференцирано променя състава на микробиотата на червата в зависимост от състава на желязото (железен сулфат, железен бисглицинат и железен етилендиаминтетраоцетна киселина), който присъства в диетата (Constante et al., 2017). Въпреки това, в допълнение към улавянето на не-хем желязо, много бактерии умеят и да улавят хем желязо.

Бактериалните системи за усвояване на хем се състоят от поредица протеини, за да усетят и сигнализират за регулиране нагоре на транспортните протеини на хема, свързват хема с висок афинитет и транслокират хема в цитоплазмата (Tong and Guo, 2009). Бактериите имат разнообразни хемотранспортни системи, които включват директно усвояване на хем или хем протеини (напр. Хемопексин, хемоглобин, хемоглобин-хаптоглобин), хемофорирано медиирано поемане на хем или двучастични хемни рецептори, състоящи се от двупротеинова система (Tong and Guo, 2009 ). Бактериалните патогени са особено ефективни при улавяне на хем и при процъфтяване в богата на хем среда (Cescau et al., 2007; Reniere et al., 2007; Wilks and Burkhard, 2007; Tong and Guo, 2009).

Нивата на желязото на хема в луминалните черва вероятно ще окажат силно влияние върху структурата на микробната общност. Въздействието на хема върху състава на микробиотата на червата може да бъде особено важно при хронично възпаление, като например при пациенти с възпалително заболяване на червата (IBD), включващо улцерозен колит (UC) и болест на Crohn (CD). По време на възпалението гостоприемникът реагира чрез секвестиране на желязо в процес, който е измислен като „хранителен имунитет“ (Weinberg, 1977; Diaz-Ochoa et al., 2014). Този процес увеличава конкуренцията за желязо и благоприятства растежа на бактерии, които са по-добре оборудвани за набавяне на желязо от различни източници. Всъщност при пациенти с IBD постоянно се съобщава за чревна дисбиоза (Manichanh et al., 2006; Scanlan et al., 2006; Frank et al., 2007; Peterson et al., 2008; Walters et al., 2014; Winter and Baumler, 2014).

Пациентите с възпалителни заболявания на червата са изложени на повишен риск от развитие на колоректален рак (CRC) (Kim and Chang, 2014). Епидемиологичните проучвания показват, че CRC има силна връзка с консумацията на месо в западната диета (Armstrong and Doll, 1975; Sinha et al., 2009; De Stefani et al., 2012), която се проявява в зависимост от дозата (Sandhu et al., 2001; Norat et al., 2002; Larsson and Wolk, 2006). Тази асоциация се подсилва допълнително от факта, че честотата на КРС бързо се увеличава в развиващите се страни, приемащи диети по западен стил (Kim et al., 2013). При пациенти с UC, поглъщането на богато на хем червено месо увеличава вероятността от рецидив на обостряне (Jowett et al., 2004).

В това проучване ние изследвахме влиянието на диетичния хем върху микробиотата и изведения функционален състав на чревния метагеном, както и неговото въздействие върху развитието на колит и свързания с колит аденом при мишки.

Материали и методи

Животни

C57BL/6 мишки бяха отгледани и поддържани при стандартни условия 12:12 h светлина/тъмнина в Center de Recherche du CHUM (CRCHUM) и бяха поставени в клетки в четири до пет мишки на клетка. Всички процедури са извършени в съответствие с насоките на Канадския съвет за грижа за животните след одобрение от институционалния комитет за грижа за животните на CRCHUM.

Диети

За да се проучи въздействието на диетите върху микробиотата, бяха хранени мишки ad libitum контролна диета, съдържаща 50 mg/kg желязо под формата на железен сулфат (Teklad TD.120515) или диета с добавка на хем с 50 mg/kg желязо под формата на хемин (Teklad TD.120516) за 4 седмици. За експериментите с хроничен азоксиметан (AOM)/декстран натриев сулфат (DSS) за образуване на аденом, мишките са хранени с контролна диета (TD.140855) или диета, допълнена с 25 mg/kg желязо под формата на хем (TD.140856 ). Диетичните състави са подробно описани в допълнителна таблица S1.

Лечение на животни

Индуциран от декстран натриев сулфат (DSS) остър колит: Колитът се индуцира чрез прилагане на DSS (0.75% w/v от 40 000 молекулно тегло DSS; TdB Consultancy AB, Упсала, Швеция) в питейна вода на 20-25 g женски мишки в продължение на 10 дни (Chassaing et al., 2014). Получени мишки ad libitum контролна диета, съдържаща 50 mg/kg желязо под формата на железен сулфат (Teklad TD.120515; Envigo, Индианаполис, IN, САЩ) или хемин (Teklad TD.120516), започваща 1 седмица преди цикъл от 10 дни DSS . Като алтернатива се хранят мишки ad libitum контролната диета, съдържаща 50 mg/kg желязо под формата на железен сулфат (Teklad TD.120515), започваща 1 седмица преди DSS лечение. За интраперитонеално приложение на хемин използвахме същия метод, както съобщава Zhang L. et al., 2014. Хеминът се разтваря в 0,2 mol/l NaOH, титрува се до pH 7,4 с HCl и след това се разрежда с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) . Мишките бяха интраперитонеално приложени носител или 75 μmol/kg хемин (Sigma-Aldrich) 2 дни преди DSS лечение.

Азоксиметан (AOM)/DSS модел: Образуването на аденом, свързано с колит, се предизвиква чрез интраперитонеално инжектиране на 10 mg/kg AOM при 20-25 g женски мишки (De Robertis et al., 2011), които са получили ad libitum контролна диета или диета, допълнена с 25 mg/kg желязо под формата на хем, започваща 2 седмици преди инжектирането на AOM. Три дни след инжектиране на AOM, мишките бяха подложени на три цикъла от 2% DSS в продължение на 5 дни, последвани от период на възстановяване от 14 дни. След третия цикъл питейната вода се прилага без DSS в продължение на четири допълнителни седмици.

Хистологично точкуване

Парафиновите срезове на дебелото черво се оцветяват с хематоксилин и еозин, след това се подлагат на сляп анализ и се отбелязват. Резултат от възпалението: наличие на случайни възпалителни клетки в ламина проприа (присвоена стойност 0); увеличен брой възпалителни клетки в ламина проприа (стойност 1); сливане на възпалителни клетки, простиращи се в субмукозата (стойност 2); и трансмурално удължаване на инфилтрата (стойност 3) (Jia et al., 2008). Резултат от увреждане на тъканите: липса на увреждане на лигавицата (стойност 0); лимфоепителни лезии (стойност 1); повърхностна лигавична ерозия или фокална язва (стойност 2); обширни увреждания на лигавицата; и разширяване в по-дълбока структура (стойност 3) (Jia et al., 2008).

Количествена обратна транскриптаза-полимеразна верижна реакция (qRT-PCR)

Количествено определяне на хема

Хемът от изпражненията е изследван чрез флуоресценция съгласно Van den Berg et al. (1988). Накратко, съдържанието на дебелото черво от мишки веднага се замразява бързо и се поддържа при -80 ° C до разреждане във вода 1: 1 (w/w). Пробите се хомогенизират, след това се центрофугират при 1 500 × ж за 10 минути. Към 10 μl от супернатантата се добавят и се смесват 200 μl ледена оцетна киселина. Впоследствие се добавят 10 μl прясно приготвен воден разтвор на FeSO4.7H20 (0,12 mol/l) и HC1 (4,5 mol/l). Пробите незабавно се инкубират при 60 ° С в продължение на 30 минути, след което 50 μl от пробата се добавят към 100 μl 1: 1 2-пропанол/вода (v/v). Флуоресценцията беше измерена при възбуждане 400 nm и излъчване 594 nm.

Количествено определяне на фекален бутират

Бутиратът се измерва в ядрото на CRCHUM Metabolomics чрез течна хроматография-масспектрометрия, като се използва протокол, адаптиран от Han et al. (2015). Накратко, пробите се хомогенизират в 50% воден ацетонитрил, съдържащ 2,2-диметилмаслена киселина като вътрешен стандарт. След центрофугиране, водоразтворимите карбонилни групи, открити в супернатантите, се дериватизират, използвайки 3-нитрофенилхидразин, за да се получат съответните производни на фенилхидразон. Дериватизираните късоверижни мастни киселини (SCFAs) се разделят чрез високоефективна течна хроматография (Shimadzu Nexera X2 UHPLC система, Колумбия, Масачузетс, САЩ) с помощта на Poroshell 120 EC-C18, 2.1 × 75 mm, 2.7 μm колона с частици (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ), свързани към предпазна колона и градиентна подвижна фаза, съставена от мравчена киселина във вода (разтворител А) и мравчена киселина в ацетонитрил (разтворител В). Откриването беше извършено след електроспрей йонизация на Sciex 6500 масспектрометър, работещ в режим с отрицателни йони.

ДНК екстракция и секвениране MiSeq на Illumina

Общо ДНК се извлича от бързо замразено съдържание на дебелото черво, поддържано при -80 ° C с Powersoil DNA Extraction Kit (MO BIO Laboratories, Карлсбад, Калифорния, САЩ). Подготовката на библиотеката на ампликони и секвенирането за анализ на микробиота на изпражненията бяха извършени от Genome Quebec Innovation Center. Накратко, библиотеките на ампликон са конструирани с бактериални/археални PCR праймери 347F и 803R, които са насочени към V3-V4 региона на гена 16S рибозомна РНК (rRNA). Извършен е втори PCR за прикачване на примерни баркодове и адаптерни последователности, използвани от системите за секвениране Illumina. Пробите бяха нормализирани на базата на Quant-iT TM PicoGreen® dsDNA Assay Kit (ThermoFisher Scientific, Nepean, ON, Канада), обединени и пречистени с мъниста Agencourt AMPure (Beckman Coulter Canada Inc., Mississauga, ON, Canada). След проверка на качеството чрез количествено определяне на ДНК, количествена PCR в реално време и микрофлуидна гелна електрофореза, библиотеката беше секвенирана в системата MiSeq (Miseq v2 Reagent Kit, 500 цикъла PE; Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ), добавена с 20 % PhiX (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ).

Анализ на микробиота

Предварителната обработка на последователността гласи: Препращащите и обратните 16S rRNA генни последователности, получени от Illumina (достъпни в Sequence Read Archive SUB2963298), бяха подравнени една към друга, използвайки сливането с двойно четене (PEAR) (Zhang J. et al., 2014). Клъстериране на четения в оперативни таксономични единици (OTU): Използвайки софтуера „Количествени прозрения в микробната екология“ (QIIME; Caporaso et al., 2010), обединените последователности бяха приведени в съответствие с базата данни на Greengenes версия 13.8 (т.е. „затворен референтен“ подход към групирането), съдържащ последователностите за OTU, лишени от химерни последователности . Използвахме 97% база данни за сходство, за да идентифицираме бактерии на видово ниво. OTUs бяха филтрирани за отстраняване на таксони, присъстващи само в една проба и таксони с по-малко от 100 четения във всички проби. Потвърдено е, че пробите имат минимум 1000 четения.

анализ на α- и β-разнообразие: Индексът на разнообразие на Шанън е изчислен с помощта на вегетарианския пакет R (Oksanen et al., 2015). За да изследваме нивото на разликите между експериментални групи (β-разнообразие или как таксоните се споделят между групите), извършихме Анализ на главните координати (PCoA), използвайки непретегленото разстояние UniFrac (Lozupone и Knight, 2005), с R-пакета phyloseq (McMurdie и Holmes, 2012) и дисперсионния анализ (ANOVA), използвайки матрици за разстояние (Adonis), използвайки вегетарианския пакет R (Oksanen et al., 2015).

Функционален анализ: За да направим извод за метагеноми на проби от 16S рРНК генния анализ (т.е. да направим извод за гените, присъстващи в популацията на микробиотите), използвахме инструмента за филогенетично изследване на общностите чрез реконструкция на ненаблюдавани държави (PICRUSt) (Langille et al., 2013) с Предварително изчислени файлове на Greengenes за гените и пътищата на Киото енциклопедия на гени и геноми (KEGG) (Kanehisa и Goto, 2000). Тъй като базата данни Greengenes OTU не се променя от версия 13.5 на 13.8, използвахме резултатите от описаното по-горе клъстериране. След това резултатите от PICRUSt бяха анализирани, като се използва размер на ефекта на линейния дискриминант на анализа (LEfSe), за да се идентифицират микробните функции, които се различаваха значително в изобилието си между групите. FishTaco е използван за свързване на таксономични и функционални промени в микробиома (Manor and Borenstein, 2017). Средата за програмиране R (R Core Team, 2015) е използвана за генериране на графични резултати.

Статистика

За извършване на статистическия анализ са използвани R (R Core Team, 2015) и Prism. Множествените сравнения бяха оценени статистически чрез еднопосочен ANOVA. След това статистически значимите разлики бяха оценени от двустранен студент т-тестът и многократното тестване бяха коригирани чрез оценка на степента на фалшиво откриване (FDR) (Benjamini and Hochberg, 1995).

Резултати

Диетичният хем предизвиква дисбиоза, подобна на тази, открита при DSS-третирани мишки

За да изследваме ефектите на хем желязото върху състава на микробиотата в червата, анализирахме микробиота в проби от изпражнения от мишки, хранени с диета, съдържаща 50 ppm като железен сулфат (контролна диета) или 50 ppm желязо като хем, и сравнени с мишки, хранени с контролата диета, докато е подложен на DSS-индуциран колит, който причинява стомашно-чревно кървене. Както е показано на Фигура 1А, нивата на хем в изпражненията се повишават при мишки, хранени с диета, допълнена с хем, и при мишки, подложени на DSS. PCoA (Фигура 1В) показва, че мишките, хранени с контролна диета, групирани отделно от мишки, хранени с диета с добавка на хем, показва, че хемовото желязо значително променя състава на чревната микробиота. Когато се анализира α-разнообразието за богатство (Chao1) или както за равномерност, така и за богатство (Shannon), DSS-лечението показва намалено микробно разнообразие (Фигура 1C), както се очаква (Sartor, 2008; Manichanh et al., 2012). Забележително е, че хранителните добавки с хем също значително намаляват микробното разнообразие, макар и в по-малка степен от лечението с DSS (Фигура 1C).

ФИГУРА 1. Диетичният хем предизвиква чревна дисбиоза, подобна на тази, установена при мишки, лекувани с DSS. Мишките са били хранени с контролна диета (CD) или с добавка на хем (Heme) в продължение на 4 седмици, или са били хранени с контролна диета (CD) и са получавали или вода самостоятелно, или вода с DSS (CD DSS) в продължение на 10 дни (н = 8–10 мишки на група). (А) Фекален хем. (Б) анализ на главните координати с нанасяне само на ос 1 (горна част) или на двете оси 1 и ос 2 (долна част). (° С) Измервания на α-разнообразие от Шанън и Чао1. (Д) Диференциален анализ на изобилието на бактерии. ∗ P ∗∗ P ∗∗∗ P ∗ P ∗∗ P ∗∗∗ P † P ∗ P ∗∗∗ P ∗ P ∗∗ P ∗∗∗ P Ключови думи: желязо, хем, колит, аденоми, микробиота, възпалително заболяване на червата (IBD), колоректален рак (CRC), червено месо

Цитиране: Constante M, Fragoso G, Calvé A, Samba-Mondonga M и Santos MM (2017) Диетичният хем предизвиква чревна дисбиоза, утежнява колита и засилва развитието на аденоми при мишки. Отпред. Микробиол. 8: 1809. doi: 10.3389/fmicb.2017.01809

Получено: 06 юни 2017 г .; Приет: 05 септември 2017 г .;
Публикувано: 21 септември 2017 г.

Даниела Де Биасе, Университет Сапиенца ди Рома, Италия

Франсоа-Пиер Мартин, Институт по здравни науки на Нестле, Швейцария
Dong-Woo Lee, Национален университет Kyungpook, Южна Корея
Карстен Сандърс, Университет Куцтаун в Пенсилвания, САЩ