Резюме

Въведение

Диетичните полифеноли (т.е. биофлавоноиди) са разнообразна и сложна група съединения, които се намират в различни плодове, зеленчуци и листа от растения (1-6). Смята се, че консумацията на биофлавоноиди осигурява редица ползи за здравето на възрастните, включително защита срещу рак и сърдечно-съдови заболявания (1-10). Въпреки тези благоприятни ефекти, поглъщането на диетични полифеноли по време на бременност е свързано с развитието на специфични видове детска левкемия, които имат аберации в гена на смесена родова левкемия (MLL) в хромозомна лента 11q23 (11-15).

отровни

Зеленият чай, който е една от най-често консумираните напитки в света, е богат източник на полифеноли (16-19). Най-разпространените биофлавоноиди в зеления чай са катехините, главно (-) - епигалокатехин галат (EGCG) 1 и сродни съединения (16-19). В допълнение, флавоноли и други класове биофлавоноиди също присъстват (19, 20).

Тъй като диетичните полифеноли засягат редица клетъчни процеси (16, 21-26), механистичната основа за техните физиологични действия не е добре дефинирана. Въпреки това, няколко биофлавоноиди са мощни отрови на топоизомераза II (14, 27-31) и много от техните клетъчни ефекти се дължат, поне отчасти, на действията им срещу ензимите от тип II (14, 15, 28, 32-34 ).

Топоизомеразите от тип II са повсеместни ензими, които променят ДНК под и преобвиване и премахват възлите и заплитанията от генома (35-40). Гръбначните животни кодират две тясно свързани изоформи на ензима, топоизомераза IIα и β (37, 38, 40-45). Топоизомераза IIα е от съществено значение за оцеляването на активно растящите тъкани (46-48) и е необходима за правилната репликация на ДНК и хромозомната сегрегация (43, 45). Топоизомераза IIβ е необходима на клетъчно ниво, но е необходима по време на развитието (49, 50). Към днешна дата физиологичните му функции не са добре дефинирани (44, 51, 52).

За да се запази геномната цялост по време на преминаването на веригата на ДНК, топоизомеразите от тип II образуват ковалентна връзка с 5’-краищата на разцепената нуклеинова киселина (53-55). Това ковалентно ензимно разцепено ДНК междинно съединение е известно като разцепващ комплекс. Въпреки съществената природа на топоизомераза II, условията, които повишават концентрацията на разцепващи комплекси, генерират постоянни пробиви в генетичния материал (38, 40, 56-58). Ако тези прекъсвания на нишките затрупат клетката, те предизвикват пътища на смъртта (57).

Агентите, които увеличават разцепването на ДНК, медиирано от топоизомераза II, се наричат ​​отрови на топоизомераза II (38, 40, 59-62). Редица широко предписвани и много успешни противоракови лекарства са насочени към ензима тип II (38, 40, 60, 63-66). Въпреки това, активните агенти на топоизомераза II също са свързани с развитието на левкемии, които включват гена MLL (58, 67-70).

Различни от ДНК лезии (71-75), отровите от топоизомераза II могат да бъдат категоризирани в два широки класа. Членовете на първата група действат по „традиционен“ редокс-независим механизъм. Тези съединения взаимодействат с топоизомераза II на границата между протеин и ДНК (в близост до активния сайт тирозин) по нековалентен начин (38, 40, 60-62). Редокс-независимите отрови от топоизомераза II включват етопозид (76), както и няколко други противоракови лекарства. Тъй като действията на тези съединения срещу топоизомераза II не зависят от редокс химията, те не се влияят от редуциращи агенти (76). В допълнение, тези съединения индуцират сходни нива на ензимно медиирано ДНК разцепване, независимо дали се добавят към бинарния топоизомераза II-ДНК комплекс или се инкубират с ензима преди добавянето на субстрата на нуклеиновата киселина (76).

Топоизомераза II отрови от втори клас действат по редокс-зависим начин (40, 76-82) и образуват ковалентни адукти с ензима в аминокиселинните остатъци дистално от активното място (79). Най-добре характеризираните членове на тази група са хинони, като 1,4-бензохинон и метаболити на полихлориран бифенил (PCB) (76-81). Тъй като действията на тези съединения зависят от окислително-редукционната химия, способността им да усилват медиираното от топоизомераза II разцепване на ДНК се отменя от присъствието на редуциращи агенти като DTT (76, 79, 83, 84). Освен това редокс-зависимите отрови увеличават разцепването на ДНК, когато се добавят към ензимно-ДНК комплекса, но инхибират активността на топоизомераза II, когато се инкубират с протеина преди добавянето на ДНК (31, 76, 79, 83, 84).

Тъй като много биофлавоноиди са способни да преминат окислително-възстановителна химия (включително сложни реакции на окисление) (16, 21, 85-89), техният механизъм на действие срещу топоизомераза II, априори, не е очевиден. Например, докато генистеинът (изофлавон) действа изключително като традиционна отрова на топоизомераза II (30), EGCG (катехин) отравя ензима по редокс-зависим начин (31).

Поради високата консумация на диетични полифеноли и предложените взаимоотношения между тяхното въздействие върху човешкото здраве и способността да се засили разцепването на ДНК, медиирано от топоизомераза II, е важно да се разбере механизмът, чрез който те отровят ензима тип II. Следователно, настоящото проучване е предприето за определяне на структурните елементи в биофлавоноидите, които контролират механистичната основа за действията им срещу топоизомераза II. Допълнителна цел беше да се установят правила, които имат потенциал да предскажат дали даден биофлавоноид действа като традиционна (редокс-независима) или редокс-зависима отрова от топоизомераза II.

Резултатите категорично предполагат, че способността на биофлавоноидите да действат като редокс-зависими отрови зависи от множеството на –OH групи върху В пръстена. Освен това са необходими специфични характеристики на С пръстена, за да могат тези съединения да се свързват с топоизомераза II на границата ензим-ДНК и да действат като традиционни отрови. Те обаче не оказват влияние върху способността да функционират като редокс-зависими отрови.

Експериментални процедури

Ензими и материали

Рекомбинантна дива тип човешка топоизомераза IIα се експресира в Saccharomyces cerevisiae и се пречиства, както е описано по-горе (90-92). Отрицателно супернавитата pBR322 ДНК се приготвя от Escherichia coli, като се използва плазмиден мега комплект (Qiagen), както е описано от производителя. (-) - Епигалокатехин галат (EGCG), (-) - епигалокатехин (EGC), (-) - епикатехин галат (ЕКГ), (-) - епикатехин (EC), мирицетин, кверцетин и кемпферол са закупени от LKT. 1,4-бензохинон и етопозид са получени от Sigma. Всички съединения се приготвят като 20 mM изходни разтвори в 100% DMSO и се съхраняват при -20 ° C.

ДНК разцепване, медиирано от човешка топоизомераза IIα

Реакциите на разцепване на ДНК се извършват по процедурата на Fortune и Osheroff (93). Смесите за анализ съдържат 220 nM човешка топоизомераза IIα, 5 nM отрицателно суперспирална pBR322 ДНК и 0-500 μM EGCG, EGC, ECG или EC в 20 μL буфер за разцепване на ДНК [10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 5 mM MgCl2, 100 mM KCI, 0,1 mM EDTA и 2,5% (обем/обем) глицерол]. Смесите за разцепване на ДНК се инкубират в продължение на 6 минути при 37 ° С. В някои случаи се наблюдават 0–10 минути курсове за разцепване на ДНК със 100 μM мирицетин, кверцетин или кемпферол. Междинните съединения за разцепване на ензим-ДНК се улавят чрез добавяне на 2 μL 5% SDS, последвано от 1 μL 375 mM EDTA, рН 8.0. Добавя се протеиназа К (2 μL от 0,8 mg/ml разтвор) и реакционните смеси се инкубират в продължение на 30 минути при 45 ° С, за да се усвои топоизомераза II. Пробите се смесват с 2 μL 60% захароза в 10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 0,5% бромофенолно синьо и 0,5% ксилен цианол FF, загряват се в продължение на 2 минути при 45 ° C и се подлагат на електрофореза в 1% агарозни гелове в 40 mM трис-ацетат, рН 8.3 и 2 mM EDTA, съдържащ 0.5 μg/ml етидиев бромид. Разцепването на ДНК се наблюдава чрез превръщането на отрицателно суперспирална плазмидна ДНК в линейни молекули. ДНК лентите се визуализират с ултравиолетова светлина и се определят количествено, използвайки система за цифрово изобразяване Alpha Innotech.

За да се изследват ефектите на редуциращ агент върху действията на катехини срещу топоизомераза IIα, 500 μM EGCG или EGC (или 25 μM 1,4-бензохинон или 50 μM етопозид като контроли) са инкубирани с 1 mM DTT за 5 минути преди тяхното допълнение към реакции на разцепване на ДНК. Алтернативно, DTT се добавя към реакционните смеси за 5 минути след 6 минути реакция на разцепване на ДНК.

За да се изследват ефектите на редуциращ агент върху действието на флавоноли срещу топоизомераза IIα, 100 μM мирицетин, кверцетин или кемпферол са инкубирани в отсъствие или в присъствието на 1 mM DTT в продължение на 5 минути преди да се започнат реакции на разцепване на ДНК. Реакциите се наблюдават в продължение на 0-20 минути.

За да се изследват ефектите на флавонолите върху топоизомераза IIα при липса на ДНК, 100 μM мирицетин, кверцетин или кемпферол се инкубират с 220 nM ензим за 0-15 минути при 37 ° C в 15 μL буфер за разцепване на ДНК. Разцепването се инициира чрез добавяне на 5 nM отрицателно суперспирална pBR322 ДНК (в 5 μL буфер за разцепване) към реакционната смес. В някои случаи флавонолите (100 μM) се третират с 1 mM DTT в продължение на 5 минути преди инкубацията им с топоизомераза IIα.

За да се определи способността на EC да се конкурира с кверцетин за ензима тип II, бяха проведени реакции на разцепване на ДНК, съдържащи 220 nM топоизомераза IIα и 5 nM отрицателно суперспирална pBR322 ДНК в присъствието на 100 μM кверцетин и 0-1000 μM EC. Конкуренцията се определя от загубата на кверцетин-индуцирана ДНК разцепване.

Резултати

Механизъм на катехини от зелен чай като отрови от топоизомераза II

Катехините са най-разпространеният клас биологично активни полифеноли в зеления чай (приготвен от листата на Camellia sinensis) (16, 21). EGCG представлява основният катехин (~ 40-60% от общите полифеноли), последван от EGC и ЕКГ (~ 15-20% всеки) и EC (~ 5%) (23, 94). Структурите на тези съединения са показани на фигура 1 .