Резюме

въпреки епидемиологичните доказателства, че приемът на протеини се е увеличил в индустриализираните страни от три десетилетия (25, 66) и е достигнал около два пъти повече от препоръчителния прием (72), въпросът за потенциалните неблагоприятни ефекти от диетата с високо съдържание на протеини (HP) остава силно противоречив . Днес е добре установено, че диетите с НР предизвикват рано изразени метаболитни промени в човешки и животински модели, особено когато диетата съдържа поне 50% енергия като протеин (13, 17, 40, 42). Независимо от това, физиологичните и функционални последици от дългосрочната диета с НР не са напълно проучени.

Поради разпространението на наднорменото тегло и затлъстяването, особено в западните страни (41), диетите на НР често се разглеждат като алтернативна и успешна стратегия за ефективно и дългосрочно отслабване (62). Всъщност понастоящем е известно, че диетите с НР предизвикват супресивни ефекти при хранене при плъхове (5, 46) и при хора (30, 70). Нискокалоричните високо протеинови диети могат успешно да се използват за лечение на затлъстели лица (3, 70). Въпреки това, медицинската употреба на диета с ограничено ограничение за отслабване не води непременно до голямо количество прием на протеини. Когато става въпрос за спонтанен хранителен прием, приносът на високо протеиновия прием за намаляване на разпространението на наднорменото тегло не е напълно съгласен, тъй като две епидемиологични проучвания установяват положителна връзка между приема на протеини и пълнотата в ранна детска възраст (52, 64).

Сред предполагаемите неблагоприятни ефекти от диетите с НР често се спори за нарушение на чернодробните и бъбречните функции поради централната им роля в метаболизма на азота. Доказано е, че размерът на черния дроб и бъбреците се увеличава след 2 седмици HP диета при плъхове (24, 43). Освен това е доказано, че скоростта на гломерулна филтрация (GFR) се увеличава чрез прием на високо протеини (58, 73) или инфузия на аминокиселини (9, 21), но съпътстващото увреждане на бъбречната функция при здрави условия не е доказано. Подозира се също така, че дългосрочният прием на протеин стимулира инсулиновата резистентност (24, 35) и нарушава секрецията на кортизол (60). Други неблагоприятни ефекти също са напреднали, като увеличаване на отделянето на калций в урината и възможна костна резорбция (31, 34), засилване на оксидативния стрес (47) и модификация на детоксикационните ензими (49).

Предвид трудността да се реализират дългосрочни интервенционни проучвания при хора и липсата на пълни токсикологични проучвания върху високо протеиновите диетични ефекти, ние изследвахме върху широк спектър от биохимични, анатомични и хистологични параметри дали дългосрочното поглъщане на HP диета може да има неблагоприятни и/или благоприятни ефекти при предразположен към затлъстяване щам на плъхове. За тази цел мъжките плъхове Wistar са получавали или нормална протеинова (NP) диета, или HP диета за 6 месеца. Подробен телесен състав, биомаркери на оксидативен стрес [редуциран (GSH) и окислен (GSSG) глутатион, реактивни вещества с тиобарбитурова киселина (TBARS), експресия на γ-глутамил-цистеин-лигаза (γ-GCL)] и детоксикационна функция [глутатион-С-трансфераза (GST)], плазмени хормони (инсулин, кортизол и лептин), както и чернодробна и бъбречна хистопатология. Калциевият баланс също се оценява след 4 месеца от NP или HP диета.

Животни и диети.

маса 1. Състав на диетите

Експериментална процедура и вземане на проби.

След 3 и 6 месеца поглъщане или на NP диета, или на HP диета, и 1 седмица преди смъртта, периферна кръв беше взета от черепния клон на медиалната сафенозна вена на плъхове, които са гладували през нощта. Гликемията се измерва незабавно с преносим рефрактометър (Encore глюкометър; Bayer Diagnostics, Puteaux, Франция). След вземане на кръв, плъховете получават обичайното си хранене.

Тест за толерантност към глюкоза през устата е извършен след еднодневно гладуване в допълнително проучване, проведено върху 12 плъхове (н = 6/група) след 3 месеца експеримент. Постените плъхове получават 1 g/kg перорално натоварване с глюкоза и нивата на кръвната глюкоза се измерват последователно. Резултатите се изразяват като разлика между базалната глюкоза и глюкозата във всеки момент от времето. За количествено определяне на калциевия баланс, след 4 месеца от експерименталната диета, 6-месечните плъхове бяха настанени в продължение на 7 дни в отделни клетки за метаболизъм. Ежедневно се събираха урина и изпражнения; кристализиран тимол се добавя към епруветките за събиране на урина, за да се предотврати пролиферацията на бактерии. Взетите проби от урина и изпражнения се съхраняват при -20 ° C в края на всеки ден на експериментиране.

Аналитични методи.

С изключение на разтворители и алкохоли, закупени от Carlo Erba (Val de Reuil, Франция), всички химикали, използвани като реагенти, в разтвори или буфери и всички ензимни анализи са получени от Sigma-Aldrich Chimie (Saint-Quentin Fallavier, Франция). Концентрациите на урея в урината и плазмата се определят чрез ензимен анализ (набор от крайни точки за азот на урея); албуминът беше разкрит чрез реакцията му с бромокрезол лилав (Албумин комплект BCP). GST активността се измерва съгласно метода на Habig et al. (23). Накратко, GST конюгати с 1-хлоро-2,4-динитро-бензен и ензимната активност в присъствието на този ароматен субстрат се определя спектрофотометрично. За окислен (GSSG) и общ (GSH) глутатион пробите се хомогенизират в 9 обледени 0.9% NaCl. След като се филтрират, 50 μl от разтвора се замразяват при -20 ° C за извършване на количествени анализи на протеини и 300 μl се вземат проби, смесват се със 100 μl 20% сулфосалицилова киселина и се центрофугират (3000 ж, 15 минути, 4 ° С). Супернатантата беше събрана и използвана за определяне на нивата на GSH и GSSG съгласно метода, описан от Anderson (2) и нивата на TBARS съгласно техниката на Satoh (55).

Нивата на калций в урината и изпражненията (и в питейната вода и храната) се определят с помощта на пламъчен атомно-абсорбционен спектрометър (модел SpectrAA 50; Varian, Les Ulis, Франция) с въздух/ацетиленова горелка (редуциращ пламък). Преди анализ течните проби се разреждат в съотношение 1: 100 в разтвор, съдържащ 5 g/l лантанов хлорид, 1 g/l калциев хлорид и 0.2 g/l калиев хлорид. Твърдите проби (изпражнения и диети) се минерализират чрез нагряване в продължение на 2 часа (100 ° С) в 25 об. 2 N азотна киселина. Дължината на вълната на катодната лампа беше 422,7 nm.

Количествено се определят плазмените хормони, като се използват RIA комплекти със 125 I като индикатор [INSIK-5 и GammaCoat 125 I Cortisol RIA (Diasorin, Antony, Франция) за инсулин и кортизол и LEP-R61 (Mediagnost, Tuebingen, Германия) за лептин]. Радиоактивността на индикатора е количествено определена в гама сцинтилационен брояч (Cobra II Auto-Gamma; Perkin-Elmer).

Плазмените концентрации на хомоцистеин се определят с помощта на конкурентна ензимна имуноанализа с пероксидаза като ензимна система (Axis Homocysteine, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, Франция).

Образци на бъбреци и черен дроб са обработени в отделението по хистопатология на болница Avicenne (Bobigny, Франция). Тъканите бяха дехидратирани и потопени в течен парафин. Органните срезове (4 μm) бяха поставени върху предметни стъкла и оцветени с HES. Хистологичните разрези бяха изследвани под микроскоп Leica DM LB (Leica Microsystems, Rueil-Malmaison, Франция).

Статистика.

Резултатите са изразени като средни стойности ± SE. Ефектите от диетата и възрастта бяха тествани чрез двупосочна ANOVA, като се използва общата процедура на линеен модел на SAS (версия 6.11: SAS, Cary, NC). За определяне на значимостта е определено α-ниво от 0,05.

Прием на енергия, телесно тегло, телесен състав и баланс на калция.

Каквато и да е диетата, приемът на храна варира от един ден на друг, но не се наблюдава отказ или неочаквано намаляване на приема на храна през 6-месечния период. Средният дневен прием на храна след 6 месеца експеримент се различава значително между HP плъхове (348,8 ± 3,1 kJ) и NP плъхове (388,2 ± 6,8 kJ). Енергийният прием при HP плъхове е бил 87% от този, наблюдаван при плъховете NP. След 6 месеца от експерименталната диета се наблюдава значително намаляване на телесното тегло при HP плъхове в сравнение с NP плъхове. Теглото на HP плъховете е 82% от това, наблюдавано при NP плъхове.

Теглото на тялото, WAT и оголените кланични трупове се увеличават значително с възрастта (P

Таблица 2. Телесно тегло и телесен състав на плъхове след 3 месеца и 6 месеца консумация ad libitum на NP (14% протеин) или HP (50% протеин) диета

Стойностите са средни стойности ± SE. NP, нормален протеин; HP, високо протеин; изчистеният труп се почиства от трупа, без кожа, опашка, глава и дистална част на крайниците. P −1 · wk −1 съответно при плъхове NP и HP; P −1 · wk −1 съответно при плъхове NP и HP; P −1 · wk −1 съответно при плъхове NP и HP; P −1 · wk −1 съответно при плъхове NP и HP; незначителен).

Плазмени хормони, глюкоза, протеини, аминокиселини и липиди.

Концентрациите на глюкоза на гладно, инсулин, лептин и кортизол на гладно са значително по-високи при плъховете NP, отколкото при плъховете HP (Таблица 3). Имаше и значителен ефект на възрастта върху нивата на лептин в кръвта, инсулин и захар, с драстично увеличение на лептина с възрастта (P

високо

Фиг. 1.Перорални тестове за глюкозен толеранс при плъхове след 3 месеца ad libitum консумация или на нормално протеинова (NP, 14% протеин) или на високо протеинова (HP, 50% протеин) диета.

Таблица 3. Плазмени нива на гладно на хормони, глюкоза, протеини, аминокиселини, хомоцистеин, урея, креатинин и липиди при плъхове след 15 дни 3 месеца и 6 месеца консумация ad libitum или на NP (14% от протеина) или на HP (50% на протеин) диета

Стойностите са средни стойности ± SE. HDL, липопротеин с висока плътност. P

Таблица 4. Чернодробни нива на GSH, GSSH, TBARS, GST активност след 15 дни 3 месеца и 6 месеца консумация ad libitum или на NP (14% протеин) или HP (50% протеин) диета

Стойностите са средни стойности ± SE. TBARS, вещества, реагиращи с тиобарбитурова киселина; GST, глутатион-С-трансфераза. P

Фиг. 2.RT-PCR анализ на γ-глутамилцистеин лигаза (γ-GCL) в чернодробни клетки на плъхове след 3 месеца консумация ad libitum или на NP (14% протеин) или HP (50% протеин) диета. Тази RT-PCR е разработена с използване на специфични олигонуклеотиди и [33 P] dATP. Депозитите съответстваха на три екземпляра от различни плъхове, подложени на NP или HP диета за 3 месеца. Реакционните продукти се анализират чрез електрофореза в агарозен гел, последвано от оцветяване с етидиев бромид. Ред А, резултати от RT-PCR в чернодробни клетки на плъх за амплифицирания фрагмент на y-GCL (668 pb); Ред Б, очаква се PCR продукт за β-актин (353 bp) в чернодробни клетки на плъх.

Не са наблюдавани сериозни хистологични лезии в нито една група след 3 или 6 месеца експеримент. Фигура 3 показва типични хистологични разрези на черния дроб (HES оцветяване). Всички NP плъхове систематично показват подчертана чернодробна микро- и макровакуоларна стеатоза, което вероятно е свързано с тяхното прекомерно затлъстяване (Фиг. 3, А1 и А2). За разлика от това, при HP плъхове не е открита стеатоза (Фиг. 3Б.). Малки, непатологични възпалителни лезии са открити в черния дроб на два плъха в групата с HP след 6 месеца от експерименталната диета (данните не са показани). Фигура 4 показва хистологични разрези на бъбречни гломерули (PAS оцветяване). Въпреки относителната дебелина на участъците (4 μm), регулирането на фокуса позволява внимателно изследване на бъбречните тъкани. Капилярните бримки на гломерулите бяха добре дефинирани и тънки. Не се открива нефрокалциноза, област на колагенова склероза или хиперклетъчен гломерул. Ендотелните и мезангиалните клетки бяха нормални, както и околните тубули. Подобно на PAS оцветяването, HES оцветяването на бъбреците (данните не са показани) не разкрива забележима лезия. Въпреки това, един плъх от групата на HP показва локализиран и ограничен интерстициален лимфоцитен възпалителен възел, а друг HP плъх показва незначителна бъбречна лезия, показваща умерено възпаление на бъбречната папила (данните не са показани).

Фиг. 3.Чернодробни хистологични секции при плъхове след 6 месеца ad libitum консумация на диета с NP (14% протеин) или HP (50% протеин). А1: чернодробна секция на плъх след 6 месеца консумация на NP диета; показана е микровакуолната и макровакуоларната стеатоза, наблюдавана при 8 плъха от тази група. А2: подробности за макровакуоларната стеатоза (обърнете внимание на ядрото, изтласкано от клетъчната мембрана). Б.: чернодробна секция на един плъх след 6 месеца поглъщане на HP диета.


Фиг. 4.Бъбречна хистология при плъхове след 6 месеца ad libitum консумация или на NP (14% от протеин; A) или HP (50% протеин; Б.) диета.

Целта на това проучване е да се оценят последиците от дългосрочния прием на високи нива на протеин в склонна към затлъстяване щам на плъхове. Резултатите показаха, че продължителната консумация ad libitum на високо протеинова диета значително намалява приема на храна и намалява WAT, в съответствие с няколко междинни проучвания. Едновременно с това се подобряват нивата на базален кръвен инсулин, лептин и триглицериди и глюкозният толеранс. Калциевият баланс не се влияе от високия прием на млечни протеини. Освен това, за разлика от общоприетото, не се съобщава за нежелани ефекти от диетата с НР, особено по отношение на чернодробната и бъбречната хистопатология.

Много проучвания при хора със затлъстяване и с наднормено тегло показват хиперинсулинемия при хора с намалено ниво на холестерол в плазмата, свързано със загуба на тегло, независимо от вида на диетата (10, 44). Въпреки че често се подозира хиперхолестеролемичен ефект на казеин, особено в сравнение с източник на бобови протеини (22, 38), не открихме никакво увеличение на циркулиращия холестерол при плъхове с HP, консумиращи три пъти повече млечен протеин от плъховете NP. В съгласие с проучвания, проведени при хора (14, 33), ние също съобщаваме за стабилизиране на серумните концентрации на триацилглицерол с възрастта при HP плъхове, докато триглицеридите се увеличават от 15 дни до 6 месеца при NP плъхове. Тази разлика вероятно е свързана с по-ниското съдържание на въглехидрати в HP диетата.

Предвид ролята на черния дроб и бъбреците в метаболизма на аминокиселините и азота, диетите с НР са заподозрени, че имат потенциално вредни ефекти върху структурата и функцията на тези органи. Черният дроб е идентифициран рано като основен участник в метаболизма на урея и глутамин (32). Скоростта на производство на урея варира линейно с приема на протеини при здрави възрастни (74). Известно е, че активността на няколко ензима, като треонин дехидратаза, трансаминази и глутаминаза, се увеличава драстично при животни, хранени с НР диети (29, 46, 51, 56, 69). Увеличението на митохондриалното окисление в чернодробните клетки на плъхове, хранени с HP диети (26, 51) доведе до заключението, че оксидативният стрес се засилва с тази диета. Съответно установихме умерено, но значително повишаване на окислителните активности, отразено от чернодробните нива на GSH и GST дейности. Въпреки това, TBARS и експресията на γ-GCL не са засегнати от диетата и стойността на GSH в групата на HP остава във физиологичен диапазон. Нашите резултати показват, че ефектът от приема на високо протеини върху оксидативния стрес е противоречив, както може да се илюстрира от резултатите на Petzke et al. (47), които не са открили промяна в нивата на GSH в кръвта или черния дроб след 4-месечното поглъщане ad libitum на 51,3% протеинова диета.

Извършихме това проучване, за да проучим дали диетата на HP може да бъде вредна за здравите животни за дълъг период, представляващ една четвърт от живота им. Би било почти невъзможно да се проведе изследване на еквивалентен период при хора. Можем да заключим, че при мъжки плъхове приемът на протеин, три пъти по-висок от изискванията, не е имал неблагоприятни ефекти върху бъбречните и чернодробните функции, оксидативен стрес или калциев баланс. Напротив, обменът на въглехидрати с протеини е от полза по отношение на телесния състав, базалните триглицериди, глюкозата, лептина и инсулиновите плазмени концентрации. Резултатите от настоящото проучване са съгласни с идеята, че дългосрочното управление на диетата е от основно значение за предотвратяване на затлъстяването и неговия корелативен Х синдром. Необходими са допълнителни изследвания, за да се уточнят съответните ефекти от загубата на тегло и приема на високо протеини върху глюкозния и липидния метаболизъм.

СТЪПКИ

Разходите за публикуване на тази статия бяха покрити отчасти чрез плащането на такси за страница. Следователно статията трябва да бъде маркирана с „реклама”В съответствие с 18 U.S.C. Раздел 1734 единствено, за да посочи този факт.

Благодарни сме на Cecile Bos, Ahmed Bensaïd, Jean-Christophe Bouthegourd и Catherine Luengo за умелата помощ при убиването на животните, Christiane Larue-Achagiotis за помощ при анализи на лептин и Alain Bermond от отдела за аналитична химия на INA-PG за помощ при измерване на калций.