1 Лаборатория по екотоксикология, Департамент по околна среда, Испански национален институт за земеделски и хранителни изследвания и технологии (INIA), Carretera de la Coruña, Km 7.5, 28040 Мадрид, Испания

Резюме

Биологично активните вещества могат да достигнат до водното отделение, когато отпадъците от добитък се считат за рециклиране. Наскоро беше поставен под въпрос стандартизираният анализ на FETAX и някои изследователи смятат, че оценката на риска, извършена върху риби, не може да бъде достатъчно защитна, за да покрие земноводните. В настоящото изследване a Xenopus laevis остър анализ е разработен с цел сравняване на чувствителността на ларвите спрямо риба или FETAX анализи; за излагане на ларвите са използвани ветеринарни лекарства (ивермектин, окситетрациклин, тетрациклин, сулфаметоксазол и триметоприм) и основни метали (цинк, мед, манган и селен), които могат да бъдат намерени в отпадъците от добитък. Смъртоносна (

) и са оценени сублеталните ефекти. Наличните данни и при проучванията за риба, и при FETAX като цяло са по-защитни от стойностите, установени в настоящото проучване, но не във всички случаи. Освен това, наличието на нелетални ефекти, причинени от ивермектин, цинк и мед, предполага, че могат да бъдат засегнати няколко физиологични механизма. По този начин този вид ефекти трябва да бъдат задълбочено проучени. Резултатите, получени в настоящото изследване, биха могли да разширят информацията за микро замърсителите от отпадъците от добитък върху земноводни.

1. Въведение

Ветеринарните лекарства се използват широко за лечение на болести и за защита на здравето на животните [1]. Хранителните добавки за повишаване на хранителния растеж (стимулатори на растежа) също са включени във фуражите на животните, за да се подобрят темповете им на растеж [2]. Един от най-важните проблеми, които могат да възникнат, когато отпадъците от добитък се считат за оползотворяване, повторна употреба и рециклиране, е наличието на биологично активни вещества в тези отпадъци, като ветеринарни лекарства, биоциди и добавки за фуражи, които в малки концентрации биха могли имат потенциални токсични ефекти върху водните организми. В настоящата работа са изследвани пет ветеринарни лекарства и четири основни метала, използвани като минерални добавки или хранителни добавки в животновъдството при остри статични тестове, като се използват Xenopus laevis като животински модел.

Ветеринарните лекарства, избрани за провеждане на тестовете, са ивермектин, окситетрациклин, тетрациклин, сулфаметоксазол и триметоприм. Използвани са последните две лекарства, като се запазват същите пропорции, представени в търговската химиотерапия Septrin (400 mg сулфаметоксазол и 80 mg триметоприм). Тези лекарства са избрани, тъй като те са най-често използвани в животновъдството в рамките на съответните им категории [3–6]. Четирите изследвани основни метала са цинк (Zn), мед (Cu), манган (Mn) и селен (Se). Микроконцентрациите на основни метали са необходими в диетата за много биологични процеси, особено ензимните функции, и те имат положително влияние върху растежа и размножаването на добитъка [2]. Поради ниското съдържание на основни метали в някои фуражи в сравнение с препоръките, добавянето на тези метали е необходимо за повечето видове животни и те обикновено се добавят към ежедневните дажби като минерални добавки (напр. Calfostonic, Bovis).

За изследване на остра токсичност при земноводни понастоящем се използва Тест за жаба за ембриотератогенеза-Xenopus (FETAX) [7]. Анализът FETAX е стандартизиран тест за 4-дневна експозиция с Xenopus laevis ембриони от етап 8 до етап 46, според таблицата на Nieuwkoop и Faber [8]. В сравнение с други нестандартизирани тестове, FETAX анализът има предимството да оцени голям брой параметри в едно проучване [9]. Тъй като обаче не е известно как излагането на токсични вещества в ембрионалния стадий може да повлияе на чувствителността, резултатите, получени от FETAX теста и тяхното използване за оценка на риска за околната среда, бяха поставени под въпрос от Hoke и Ankley [10].

По този начин, една от целите на настоящото проучване е да се разработи остър тест за сравняване на потенциалната чувствителност към токсични вещества между ларви и ембрион в X. laevis. Освен това малко се знае относно относителната чувствителност на земноводните към токсични вещества в сравнение с други по-традиционни водни тестови видове, като риба. Въпреки че са проведени значителни изследвания в областта на биологията на развитието с X. laevis, има малко данни за токсикологията за този вид в сравнение с рибите [10]. Чрез настоящия анализ на остри ларви, ние изследвахме възможността оценката на риска, извършена върху риби, да не може да бъде достатъчно защитна за други водни видове, като земноводни. Получените резултати биха могли да разширят съществуващата информация за екотоксикологичните ефекти на възможните микро замърсители, присъстващи в отпадъците от животни върху земноводните.

2. Материали и методи

2.1. Химикали

Сулфаметоксазол, триметоприм, ивермектин и триетиленгликол (99% чист) са закупени от Sigma (Steinheim, Германия). Тетрациклин (тетрациклин хидрат, 99% чист) е получен от Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Окситетрациклин (окситетрациклин хидрохлорид ≥99% чист), цинков сулфат (цинков сулфат 7-хидрат ≥99% чист) и меден хлорид (меден II хлорид 2-хидрат) са предоставени от Panreac (Барселона, Испания). Манганов сулфат (манганов II сулфат монохидрат ≥99% чист) и натриев селенит (натриев селенит 5-хидрат за анализ) са закупени от Merck (Германия). Свръхчиста вода се получава чрез система за пречистване на вода Milli-Q Synthesis.

2.2. Тестови организми

Xenopus laevis попови лъжички, етап 47 според Ксенопус таблица на развитие [8], са получени от вътрешно отглеждане на възрастни животни. Възрастните са настанени в пластмасови аквариуми в група от 10 души, с 40 L дехлорирана чешмяна вода. Стайната температура беше зададена на 22 ± 1 ° C при 12: 12 часа светлина: тъмно фотопериод. Жабите се хранеха с настъргани гранули с пъстърва (REPRODUCTORES, Dibaq, Испания) два пъти седмично, 2-3 часа преди всяка смяна на водата. Манипулацията с животни се извършва в съответствие с протокола на Американското общество за изпитване на материали [7]. Хвърляне на хайвера на възрастен X. laevis е индуциран от две инжекции на човешки хорион гонадотропин (hCG-LEPORI 2500, Angelini, Италия) в дорзалната лимфна торбичка, на разстояние 8 часа. Мъжът получава 400 международни единици (IU) hCG при всяка инжекция. Жената получи 250 IU при първата инжекция и 800 IU при следващата инжекция. Боголовците бяха променени в прясна среда FETAX с цедка от неръждаема стомана 5 d след наторяване и хранени ежедневно с търговска риба на прах суха храна (SERA MICRON, Германия) ad libitum.

2.3. Тестове за токсичност

Всички процедури са проведени по протоколи, одобрени от Етичния комитет за изследване на животни към Испанския национален институт за земеделски и хранителни изследвания и технологии. Бяха проведени предварителни експерименти за откриване на обхват, за да се определят подходящите граници на концентрация за тестваните химикали (данните не са показани). След това бяха проведени краткосрочни тестове (4 d), за да се установи острата летална токсичност на изпитваните вещества и да се идентифицират потенциалните сублетални ефекти.

2.3.1. Ветеринарни лекарства

Тестовете бяха проведени в 52 стъклени буркана, разположени във водна баня, поддържана при 22 ± 1 ° C на 12: 12 часа светлина: тъмен фотопериод. Буркани бяха поставени в един блок 4 × 13 и позициите за третиране и повторение бяха разпределени на случаен принцип. Групи от 5 ларви бяха изложени във всеки стъклен буркан, съдържащ 100 ml средни разтвори. Всички тестове бяха проведени с четири повторения. Експозициите се провеждат в разтворена водна среда, подходяща за анализ на жабата ембриотератогенеза-Ксенопус, FETAX среда [11]. Боголовците бяха изложени при статичен анализ в продължение на 4 дни на серийни разреждания на четири различни лекарства: S + T, TC и OTC с първоначални номинални концентрации 50 и 100 mg/L и IVE с първоначални номинални концентрации 1,075, 2,15, 4.3, 8.6 и 17.2

g/L. Поради ограничената водна разтворимост на тетрациклин и ивермектин, триетилен гликол се използва като носител. Във всички експерименти концентрацията на разтворителя не надвишава концентрацията от 1,6% (v/v), съгласно насоките на ASTM [7]. Ларвите се проверявали всеки ден за морфологични аномалии, забавяне на развитието, поведение при плуване и смъртност и всички мъртви попови лъчи били преброени и отстранени.

2.3.2. Основни метали

Условията на експозиция са същите, както е описано по-горе. Буркани (

) бяха поставени на случаен принцип в два блока 3 × 14. В този случай не е използван SC. Боголовците бяха изложени на пет геометрични серийни разреждания на четири различни съединения: цинков сулфат (ZnSO4 * 7 H2O), меден хлорид (CuCl2 * 2 H2O), манганов сулфат (MnSO4 * H2O) и натриев селенит (NaSeO3 * 5 H2O), с целта да се постигнат съответните номинални концентрации на метали, показани в таблица 1.

2.4. Статистически анализи

За всяка проба с визуално различими аномалии е използван пробит анализ (Statgraphics 5.1, StatPoint Technologies, INC., USA) за изчисляване на концентрациите на ефекта в 50% от случаите (ECs50) с 95% доверителни интервали. Същият анализ се използва за изчисляване на летални концентрации (LCs50). Значимостта на крайните точки по отношение на контролните данни е оценена чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), с най-малко значимата разлика на Fisher (LSD,

), в софтуера Statgraphics 5.1.

3. Резултати

защитни

Оток в оптичните и коремните области на X. laevis попова лъжичка, причинена от всички номинални концентрации на експозиция на Zn (2.73, 5.46, 10.91 и 21.83 mg/L), с изключение на най-ниската (1.36 mg/L). O: оптичен и A: коремен.

4. Дискусия

Протоколите за оценка на риска за околната среда за замърсители или сложни смеси включват екотоксикологични анализи с риби за изследване на ефектите от остра и хронична експозиция върху стадии на ларви или възрастни. По същия начин, в случая на земноводни, би било особено важно да се знаят острите и хронични ефекти на различни етапи на развитие, причинени от биологично активни вещества като биоциди и ветеринарни лекарства. Освен това липсата на стандартизирани тестове за токсичност с земноводни и последващите ограничения във висококачествените токсикологични данни за проспективна или диагностична оценка продължават да представляват проблем и често възпрепятстват включването на земноводни в ERA. Новият аспект на настоящото проучване се състои в използването на екотоксикологичен анализ с фаза на ларви на X. laevis, не често използван възрастов стадий, за сравняване на ефектите от остра експозиция, причинена от биологично активни вещества, с данни, получени от FETAX или рибни анализи.

g/L и 48 h LC50 стойност за D. magna е 25 ng/L [27]. Поради ивермектиновия механизъм на действие, Дафния е определен за най-чувствителния лабораторен индикатор на организма [27].

Наличните данни за остри ефекти при FETAX анализ обикновено са по-защитни от стойностите, установени в настоящото проучване за X. laevis 47 ларви от стадий, но предишни данни, получени от анализи на риба, не винаги могат да бъдат достатъчно защитни. Например, X. laevis изложени на NaSeO3 ларви показват по-висока чувствителност от дъговата пъстърва [19] (Таблица 2). В допълнение, наличието на летални ефекти, причинени от IVE, Zn и Cu, предполага, че тези вещества са в състояние да предизвикат реакция на организма. Например, ларвите, засегнати от Cu, са слабо развити и безцветни, докато IVE нарушава тяхното движение и ориентация. Подобни ефекти могат да бъдат проблематични в естествената среда чрез увеличаване на податливостта на ларвите към хищничество, както се съобщава от Yuan [28] за белезникавите, причинени от експозиция на трифенилтин, или намаляване на успеха в търсенето, което води до намалено отглеждане и развитие. Промените в когнитивната и психомоторната функция, като хиперактивността, индуцирана от IVE, обикновено са свързани с токсичната невропатия [29], докато бъбречната дисфункция или по-общо променящият се метаболизъм биха могли да причинят отоци при животните, изложени на Zn (Фигура 1).

Въз основа на проучванията, анализът FETAX изглежда полезен при оценката на екотоксикологичната опасност, но анализите на рибата може да не са винаги достатъчно защитни за земноводните. Освен това, данните от няколко проучвания показват, че ларвите на земноводните в късен стадий могат да бъдат по-чувствителни към някои химични вещества, отколкото традиционните водни биоиндикатори [30], както се случи в настоящото проучване за метали и за тези видове земноводни, които прекарват целия си жизнен цикъл в вода (напр. Pipidae, Cryptobranchidae), излагането на ларви би било по-точно от FETAX анализа [18]. Необходимо е да се подчертае необходимостта от проучване и предотвратяване на видове земноводни. Наличието на сублетални ефекти, причинени от различни съединения, трябва да се изследва, като се вземат предвид други крайни точки, които могат да повлияят на няколко физиологични механизма в сублетален модел, като имунотоксичност или по-широк спектър от етапи на ларви на животни.

Разкриване

Авторите нямат никаква финансова връзка с търговските идентичности, споменати в статията.

Благодарности

Тази работа е финансирана от Испански проекти RTA 2010-00004-C02-00 и CTM 2010 19779-C02-01. Ф. Мартини беше подкрепен с договор от испанския организъм „Consejería de Educación de la Comunidad de Madrid“ и Европейския социален фонд. Авторите благодарят на Пилар Гарсия-Хортигуела за нейната техническа помощ.

Препратки