Резюме

1. Въведение

ефект

Химична структура на COS.

Въз основа на предишните проучвания върху биологичната активност на COS, разумно е да се вярва, че този олигозахарид може да притежава значителен потенциал да бъде използван в областта против стареене. Съществуват обаче ограничени знания за защитните ефекти на този естествен полизахарид с ниско молекулно тегло срещу d -галактоза (d -gal) -индуцирано субакутно стареене in vivo. Следователно, настоящото проучване има за цел да изследва анти-стареещата активност на COS чрез интрагастрален сонда при d -gal-индуцирани подостри стареещи мишки главно чрез измерване на параметрите на оксидативния стрес, както и оценка на макроскопичния и хистопатологичния статус на мишките и/или тяхното основни органи за осигуряване на новаторска фармакологична основа за антиейдж ефекта на COS.

2. Резултати

2.1. Ежедневно наблюдение на поведението

Телесното тегло на мишките по време на периода на лечение.

2.2. Ефект на COS върху имунната функция

Тъй като далакът и тимусът са видни имунни органи, показателите за тях могат да отразяват силата на имунния статус или подобряването на имунната функция [10]. Както е показано в таблица 1, след осемседмично лечение с d -gal, индексите на далака и тимуса на мишките от моделната група са забележимо по-ниски от тези в нормалната група, което показва, че имунната система на мишката е инхибирана от приложението на d -гал за 56 последователни дни. Нещо повече, намалените индекси на далака и тимуса на мишки, предизвикани от лечение с d -gal, постепенно се регулират до известна степен след приложението на COS. Освен това, нашите резултати (както е разкрито в таблица 1) също разкриват, че серумните нива на имуноглобулин G (IgG) и IgM видимо намаляват при мишки от моделна група в сравнение с тези в нормалната група. Независимо от това, след като са били изследвани с COS, нивата на IgG и IgM са били ясно повишени по дозозависим начин.

маса 1

Ефекти на COS върху органните показатели и имунната функция при мишки, третирани с d -gal.

Групи Индекс на органи (mg/g) Имунна функцияТимус Далак Igg (g/L) IgM (g/L)
Нормално0,22 ± 0,050,58 ± 0,280,80 ± 0,030,16 ± 0,03
Модел0,14 ± 0,05 # 0,34 ± 0,09 # 0,57 ± 0,04 # 0,07 ± 0,02 #
VE0,19 ± 0,040,43 ± 0,160,61 ± 0,050,10 ± 0,03
COS-L0,14 ± 0,040,42 ± 0,070,70 ± 0,04 *0,08 ± 0,02
COS-M0,16 ± 0,060,49 ± 0,23 *0,72 ± 0,07 *0,11 ± 0,02 *
COS-H0,19 ± 0,050,53 ± 0,14 *0,77 ± 0,08 *0,12 ± 0,02 *

Данните представляват средни стойности ± стандартно отклонение (SD) (n = 8). # третирани с dd -gal мишки бяха оценени чрез измерване на серумните нива на аланин аминотрансфераза (ALT), аспартат трансаминаза (AST) и алкална фосфатаза (ALP). Както се вижда в Таблица 2, след третиране с d -gal в продължение на осем седмици, мишките от моделната група показват значително увеличение на серумните нива на ALT, AST и ALP в сравнение с нормалните мишки (всички pd -gal-предизвикани необичайно високи нива на ALT, AST и ALP в мишки серум постепенно намаляват до известна степен в групи, лекувани с VE и COS, в сравнение с мишки от моделна група, особено за групата COS-H, и тези нива са значително по-ниски от тези в модела група (всички мишки, третирани с pd -gal.

Функции на Черния дроб Функция на бъбрецитеALP (U/L) ALP (U/L) AST (U/L) CREA (μmol/L) UA (μmol/L)
Нормално50,08 ± 5,4620,88 ± 3,1753,79 ± 4,4051,46 ± 3,08125,24 ± 9,52
Модел82,26 ± 3,09 # 28.20 ± 4.39 # 78,51 ± 3,77 # 61,49 ± 5,53 # 162,55 ± 8,93 #
VE69,26 ± 6,05 *22,05 ± 4,02 *68,61 ± 5,24 *58,36 ± 6,28142,83 ± 7,76 *
COS-L68,28 ± 4,57 *25,59 ± 3,6365,15 ± 4,21 *55,51 ± 3,36160,33 ± 5,55
COS-M64,07 ± 3,29 *20,45 ± 2,05 *60,08 ± 2,26 *53,14 ± 3,70 *139,13 ± 11,03 *
COS-H58,85 ± 4,83 *19,10 ± 1,52 *57,01 ± 3,67 *51,99 ± 1,09 *130,39 ± 8,65 *

Данните представляват средни стойности ± SD (n = 8). # pd -gal инжектирани мишки бяха оценени чрез измерване на нивата на креатинин (CREA) и пикочна киселина (UA) в техния серум, а резултатите са представени и в таблица 2, която разкрива, че серумните нива на CREA и UA за модела групови мишки са значително по-високи от нормалните групови мишки (всички pd -Gal-индуцирани хистохимични увреждания на черния дроб и бъбреците

Както е показано на Фигура 3, нормалната хистологична структура на чернодробната тъкан е ясно видима при мишките с нормална група, включително повсеместни полигонални хепатоцити, радиално обхванати чернодробни връзки около централната вена и леко бинуклеиране на хепатоцитите. След осемседмично непрекъснато инжектиране на d -gal, чернодробната тъкан разкрива увеличен брой бинуклеация на хепатоцити, музично подредена чернодробна връв, широко разпространено хепатоцелуларно балониране и редица възпалителни клетъчни инфилтрации. Независимо от това, за групата, лекувана с COS-H, добре подредени чернодробни връзки се наблюдават по-малко възпалителни инфилтрации и бинуклеация на хепатоцити в тъканите на черния дроб на мишките, докато балониращите хепатоцити намаляват в зависимост от дозата, което показва, че COS може да подобри d - гал-индуцирано увреждане на черния дроб до известна степен.

Хистопатологичен вид на черния дроб (хематоксилин-еозин (HE), оцветяване 400 ×). Двуядрено образуване на хепатоцит (черна стрелка), чернодробна връв, разположена мъдро (жълта стрелка) и балониращ хепатоцит (червена стрелка).

В допълнение, хистопатологичните анализи на бъбречна тъкан на третирани с d -gal мишки разкриват, че гломерулът показва очевидна атрофия или дори изчезва, докато разширената в балон кухина и капка епителни клетки в бъбречните проксимални свити тубули, както и обширен бъбречен оток, може да възникне в сравнение с нормалната група (както е показано на Фигура 4). По-специално, лечението с COS и VE значително отслабва тези нездравословни патологични промени в бъбречната тъкан, причинени от d -gal, проявяващи защитна активност на бъбреците, докато бъбречният оток и разширената балонна кухина са до голяма степен контролирани за групата на COS-H. Тези резултати показаха, че COS успешно облекчава тези d -gal-индуцирани патологични увреждания в черния дроб и бъбречните тъкани на мишки Kunming (KM мишки).

Хистопатологичен вид на бъбреците (HE оцветяване 400 ×). Атрофия (жълта стрелка), капка епителни клетки в бъбречните проксимални извити каналчета (черна стрелка) и разширена балонна кухина (червена стрелка).

2.5. Ефект на COS върху показателите за антиоксидация на черния дроб и бъбреците

Предишни проучвания показват, че антиоксидантните ензими могат да предпазят черния дроб и бъбреците от индуцирано от d -gal подостро стареене чрез изчистване на ROS. Следователно, дейностите на SOD, CAT и GSH-Px, както и съдържанието на малондиалдехид (MDA), бяха изследвани в нашето настоящо проучване [5,6,7]. Както е илюстрирано на Фигура 5, след подкожно инжектиране на d -gal в продължение на осем седмици, активността на тези три ключови антиоксидантни ензима рязко намалява в сравнение с тези в чернодробните и бъбречните тъкани на нормални мишки от групата, докато обратното е вярно за MDA ниво (всички pd -gal постепенно се повишават до степен, по-висока от тази на мишките от моделната група, а нивото на MDA се отслабва от COS по дозозависим начин (особено при група COS-H, третирани с pd -gal мишки.

Ефект на COS върху дейностите на SOD, GSH-Px и CAT, както и нивата на MDA в черния дроб на мишки (A) и бъбреците (Б.), причинени от d -gal. Данните представляват средни стойности ± SD (n = 8). # p d-лекувана група; VE: d -gal плюс VE група за лечение; COS-L: d -gal плюс COS (300 mg/kg/ден) група за лечение; COS-M: d -gal плюс COS (600 mg/kg) група за лечение; COS-H: d -gal плюс COS (1200 mg/kg) група за лечение.

3. Дискусия

В обобщение, VE, мономерът на който често се използва като положителен контрол за изследванията на подострото стареене при мишки, индуцирани от d -gal, е добре известен мастноразтворим витамин с отлична антиоксидантна активност [37,39,40 ]. Като се има предвид, че VE не демонстрира видим насърчаващ ефект върху тези d -gal-произведени редукции на показателите на имунната функция на мишките, беше разумно да се направи заключението, че определен защитен ефект на VE върху черния дроб и бъбреците на d -gal-индуцираните стареещи мишки може да бъде главно поради антиоксидационното си качество. Относително, COS, получена от черупките на черупките на скариди и раци в океана, притежава различни биологични ефекти, като нарастващия ефект върху индуцираното от d -gal намаляване на показателите на имунната функция на мишки и d -gal намалява активността на ключовите антиоксидантни ензими в черния дроб и бъбреците на мишките [12,15,16,17]. За да завършим изчерпателно нашите резултати, може да се счита, че COS притежава хепатопротективен и ренопротективен ефект върху индуцираните от d -gal субакутни стареещи мишки, за да осъзнае своята анти-старееща активност, която може да бъде свързана с антиоксидантната способност на COS, както и неговата добра регулаторна роля върху имунната функция на мишките в по-голяма степен.

4. Материали и методи

4.1. Материали и химикали

COS (от хитозан от черупки на скариди чрез ензимна хидролиза, средно молекулно тегло ≤ 1000 Da, степен на деацетилиране ≥90%, степен на полимеризация 3–7, разтворим във вода), почти бял прах, е закупен от Beijing Zhong Tai He Technology (ZTH Tech, Пекин, Китай). Определено количество COS се претегля точно и се разтваря в ултрачиста вода при стайна температура, за да се получат три различни концентрации: 15, 30 и 60 mg/ml. d -gal (чистота ≥99%) и витамин Е (VE, чистота 95%) са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). d -gal се разтваря в 0,9% физиологичен разтвор за инжектиране подкожно обратно на шията на мишки в доза 250 mg/kg телесно тегло, докато VE се разтваря в дестилирана вода, съдържаща 1% разтвор на Tween 80. Наличните в търговската мрежа комплекти за IgM, IgG, GSH-Px, SOD, CAT и концентрация на протеини, както и MDA, бяха предоставени от Института по биоинженерство в Нанджин Джианчен (Нанкин, Китай). Всички други химикали и реагенти, използвани в изследването, са с аналитично качество.

4.2. Животни

Здрави седемседмични мъжки мишки KM с тегло приблизително 30 g са закупени от Центъра за лабораторни животински науки от провинция Гуангдонг (сертифициран номер: SCXK (Yue) -2013-0002). Мишките са били настанени в лабораторията за животни на Университета на океана Гуангдонг според ръководствата за грижа и използване на лабораторни животни. Мишките бяха държани в клетки при температура на околната среда 23 ± 2 ° C с 55 ± 10% относителна влажност в 12-часов автоматичен цикъл на осветление/тъмнина през експерименталния период от осем седмици. Те биха могли да получат достъп до стандартната диета с гранули и да пият вода ad libitum през целия период на изследване.

4.3. Подготовка на модел за подостро стареене на мишки и лечение на COS

След адаптация в продължение на една седмица, мишките бяха разделени на случаен принцип в шест групи по осем мишки, всяка според таблица 3. За да се установи модел на естествено стареене на мишка, d -gal (250 mg/kg/ден) се инжектира подкожно в задната част на шията на мишките веднъж дневно в продължение на 56 последователни дни. Докато мишките от нормалната група получавали еднакви количества физиологичен разтвор веднъж дневно вместо d -gal. След подкожно инжектиране на d -gal при мишки в продължение на един час, мишките в нормални и моделни групи бяха третирани с дестилирана вода чрез сонда (20 mL/kg/ден); междувременно мишките от VE група бяха третирани с VE чрез сонда (50 mg/kg/ден) като положителна контрола според последните доклади [37,39,40]. Мишките в COS-L, COS-M и COS-H групи бяха третирани с пробни разтвори (три различни дози COS) на ден чрез сондаж, съответно, които се прилагат всеки ден, както е показано в таблица 3 .