Елизабет А. Ретедал

1 Екип по хранене и здраве на храните, AgResearch (Изследователски център за пасища), Палмерстън Север, Нова Зеландия

2 Riddet Institute, University of Massey, Palmerston North, Нова Зеландия

Ерик Алтерман

1 Екип за хранене и здраве на храните, AgResearch (Изследователски център за пасища), Палмерстън Север, Нова Зеландия

2 Riddet Institute, University of Massey, Palmerston North, Нова Зеландия

Никол К. Рой

1 Екип по хранене и здраве на храните, AgResearch (Изследователски център за пасища), Палмерстън Север, Нова Зеландия

2 Riddet Institute, University of Massey, Palmerston North, Нова Зеландия

3 Националното научно предизвикателство за храненето с висока стойност, Северна Палмерстън, Нова Зеландия

Джули Е. Далзиел

1 Екип по хранене и здраве на храните, AgResearch (Изследователски център за пасища), Палмерстън Север, Нова Зеландия

2 Riddet Institute, University of Massey, Palmerston North, Нова Зеландия

Свързани данни

Данните за последователността са депозирани в архива на NCBI SRA под Bioproject # PRJNA473571.

Резюме

Въведение

Старата поговорка „Вие сте това, което ядете“, сега изглежда точно отразява доказателствата за състава и функцията на чревния микробиом. Докато други фактори като генетиката (Turnbaugh et al., 2009) изглежда играят роля, факторите на околната среда като диетата са събрали голямо количество доказателства за тяхното влияние при изграждането и модифицирането на чревните микробни общности (Spor et al., 2011; David et al., 2014; Bokulich et al., 2016). Микробиомът има жизненоважна и сложна симбиотична връзка с техния приемник и финият баланс между двете изглежда необходим за поддържане на оптимално здраве. Въпреки че има ограничени проучвания, които конкретно доказват причина и следствие (т.е. дали микробиота дисбиозата причинява заболяване или заболяване, което измества микробиотата), редица здравословни състояния, включително затлъстяване, диабет и възпалителни заболявания на червата (IBD), имат е свързана с промени в чревния микробиом (Ley et al., 2005; Frank et al., 2007; Cho and Blaser, 2012). Опитвайки се да изясни какво движи и представлява балансиран чревен микробиом и как можем да го поддържаме или насочваме благоприятно да го променим, насърчи изследванията за разбиране на ефектите на храната върху чревния микробиом.

Ферментиралите храни имат дълга история на употреба при хората и са свързани с редица ползи за здравето (Hata et al., 1996; Kawase et al., 2000; Guyonnet et al., 2007). Консумацията на ферментирали продукти е свързана с подобрения в нивата на холестерола и кръвното налягане, намален риск от диабет тип 2 и намаляване на нередностите в червата (Chen et al., 2014; Fekete et al., 2015; Cardoso Umbelino Cavallini et al., 2016; Díaz-López et al., 2016; Laatikainen et al., 2016; Nagata et al., 2016). За да се получат ферментирали хранителни продукти, към храната се добавят живи микроорганизми, а метаболитните дейности променят физическите и хранителните характеристики чрез разграждане на сложни компоненти и образуване на странични продукти.

Въпреки че много проучвания приписват наблюдаваните ползи за здравето на живите микроорганизми във ферментиралите храни, някои проучвания показват благоприятни ефекти на ферментирали продукти, които не съдържат жизнеспособни микроорганизми (Ouwehand and Salminen, 1998). Тези ефекти се дължат на взаимодействието на нежизнеспособни бактерии директно с имунната система или продуктите на микробната ферментация, като биоактивни пептиди (Ouwehand and Salminen, 1998). Доказано е, че пречистените версии на тези пептиди имат ефект върху растежа на бактериите (Hartmann and Meisel, 2007; Erdmann et al., 2008), което може потенциално да промени състава и функциите на чревната микробиота.

Киселото мляко е една от най-често консумираните ферментирали храни. Въпреки че кравето мляко се използва най-често, за търговията с кисело мляко се предлагат множество други млека от бозайници. Използването на млечни продукти от не говеда е станало по-популярно на западните пазари, тъй като хората с алергии или чувствителност към краве мляко може да са в състояние да понасят продукти от не говеда (El-Agamy, 2007). Млякото от различни видове бозайници също има различни хранителни и вкусови профили, което може да насърчи консумацията им.

Понастоящем ни липсва разбиране за това как консумирането на ферментирали храни се различава по въздействие върху чревния микробиом от техните неферментирали форми. Известно е, че ферментацията променя хранителната наличност и биоактивните съединения, включително биоактивни пептиди, което може да се очаква да повлияе на микробиотата (Azuma et al., 1984; Liepke et al., 2002). Съществуват и някои спорове относно степента, в която ферментиралите храни са способни да повлияят на чревните микробни общности (Veiga et al., 2010, 2014; McNulty et al., 2011). Тъй като съставът на съставките на млякото се различава при бозайниците, могат да възникнат и разлики в ефекта им върху микробиотата и преди и след ферментацията.

Нашата цел беше да характеризираме ефектите на неферментирало и ферментирало мляко (кисело мляко) с произход от крави и овце върху състава на чревната микробиота. Предположихме, че ще наблюдаваме различия в бактериалните съобщества поради ферментация, но животинският произход ще повлияе по-силно на тези разлики. Плъховете са хранени с твърда диета без млечни продукти, допълнена с едно от четирите млечни лечения в продължение на 2 седмици. Тогава техните цекулни бактериални съобщества се характеризират с разглеждане на разнообразието, състава на общността и корелациите с метаданните.

Материали и методи

Плъховете, използвани в това проучване, са част от друг експеримент (паралелен), който изследва ефекта от тези млечни лечения върху времето за преминаване и характеризира техните пептидни профили и потенциална биоактивност (Dalziel et al., 2018). Тук отделно оценихме цекулното съдържание след приключването на това проучване. Методите за изследване върху животни и млечни напитки са описани в Dalziel et al. (2018), но повтори тук за яснота.

Млечни напитки Лечения

Добавя се обезмаслено краве мляко на прах [SMP 001 (111115)] (38% протеин, ®). Тази стартерна култура е избрана заради своята надеждност при производството на постоянен продукт като кисело мляко за пиене. Инокулираните млека се инкубират при 43 ° С, докато рН спадне до 4,5 (4 до 5 часа). След това киселите млека бяха замразени при -20 ° C в плитки тави. За да се намали жизнеспособността на бактериите и да се подобри сушенето чрез замразяване, киселите млека се отгряват чрез размразяване до -5 ° C и замразяване при -20 ° C преди лиофилно сушене.

Млечните напитки се приготвят за употреба чрез възстановяване на млякото или киселото мляко на прах до 3% концентрация на протеин във вода и смесване за 30 s. Напитките се приготвяха ежедневно и се даваха като две храни с половина, държани при 4 ° C преди употреба в експеримента с животни. Избрана е 3% протеинова концентрация, за да може киселото мляко да бъде доставено като свободно течащо питейно вещество.

За определяне на бактериалната жизнеспособност на S. thermophilus и L. delbrueckii ssp. bulgaricus в млечни напитки, млека и кисели млека се суспендират отново във вода при 3% протеин чрез смесване (30 s). Провеждат се серийни разреждания във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) и 100 μL разпределение върху селективни агарови плаки в три екземпляра. S. thermophilus се отглежда при 37 ° С в продължение на 24–48 часа на агар на Mitis Salivarius при условия на 5% CO2. L. delbrueckii ssp. bulgaricus се отглежда при 45 ° С в продължение на 72 часа върху MRS агар (рН 5,2) (Fort Richard Laboratories Ltd, Окланд, Нова Зеландия) при анаеробни условия. L. delbrueckii ssp. bulgaricus не е открит в проби от мляко или кисело мляко. S. thermophilus е възстановен за кравето кисело мляко (4,5 × 106 CFU/mL) и овче кисело мляко (1,5 × 104 CFU/mL), но не е възстановено от млека.

Грижа за животните и дизайн на проучването

Проучването върху животни е одобрено от Комитета по етика на животните на AgResearch Grasslands (Palmerston North, Нова Зеландия) (AE13501) в съответствие със Закона за хуманно отношение към животните (1999, Нова Зеландия). Четиридесет мъжки плъха Sprague-Dawley (първоначално тегло 404 ± 27 g) са получени от звеното за развъждане на дребни животни AgResearch (Хамилтън, Нова Зеландия). Плъховете са настанени индивидуално при постоянна 21 ° С с 12/12 часа цикъл светлина/тъмнина. Започвайки от 10-седмична възраст, плъховете са хранени с твърда храна без грижи AIN-93M OpenSource Diet Diet (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, САЩ) с източник на белтък от яйчен белтък. Съставът на твърдата диета за плъхове е даден в допълнителна таблица S1. На 12-седмична възраст една от четирите млечни напитки [CM, краве мляко; CY, краве кисело мляко; SM, овче мляко; SY, овче кисело мляко] се предоставят ad libitum за 14 дни (10 плъха на група). Общият здравен резултат, теглото и хранителният прием се записват три пъти седмично. След приключване на проучването плъховете бяха евтаназирани чрез вдишване на свръхдоза CO2 и цервикална дислокация. Проби от цекула се събират асептично от плъхове и веднага се съхраняват при -80 ° C.

Последователност и анализ на микробиота

Данните за последователността бяха анализирани с помощта на mothur, следвайки методите на Schloss et al. (2009, 2011). Накратко, сдвоените четения (3,519 095 предварителни контролни сдвоени четения) бяха сглобени и подложени на качествен контрол, който премахва четенията, съдържащи непризовани бази и хомополимери с повече от осем. Средният качествен резултат във всички бази е по-голям от 30, а средната дължина на последователността е 416 bp. След това последователностите бяха подравнени спрямо базата данни SILVA (издание 132) (Quast et al., 2013). След подравняването на последователността и филтрирането, четенето на последователността премина през стъпка на предварително групиране (4 bp), предназначена да отслаби и намали ефекта от грешките в секвенирането. Химерните последователности бяха открити и отстранени с помощта на VSEARCH (Rognes et al., 2016). След таксономична класификация, небактериалните последователности бяха отстранени от анализа и последователностите бяха групирани в OTU при 97% прекъсване. Общо 1 434 251 четения останаха след всички стъпки за контрол на качеството и филтриране със средно 29 880 четения на проба. Броят на последователностите на проба е бил изваден на 17 323, за да се изравни броят на четенията в пробите за всички анализи надолу по веригата. Таблиците BIOM бяха експортирани от mothur за използване в други програми за анализ. Суровите резултати от таксономичните класификации на mothur са налични в допълнителна таблица S2.

Алфа-разнообразието беше изчислено с помощта на индекса на Шанън. Таксономичните графики бяха генерирани, използвайки класификации от mothur. LEfSe се използва за идентифициране на таксономични характеристики, които са значително различни (p ®. Извършени са множество линейни регресионни анализи с помощта на Calypso (Zakrzewski et al., 2017), за да се определят бактериалните OTU, които корелират с предварително събрани резултати от чревния транзит (Dalziel et al., 2018). Плъхове с транзитни резултати под 10 (6 плъха) бяха отстранени от анализа (2 CY, 2 SM, 2 SY), тъй като по-рано беше показано, че ~ 10% от животните могат значително да забавят изпразването на стомаха, което води до неизползваем транзит данни (Dalziel et al., 2016).

Статистически анализи

Сравненията между стойностите на диетичния прием и теглото на плъховете бяха анализирани с помощта на еднопосочна ANOVA. Стандартните отклонения (SD) също бяха изчислени и отчетени за средния прием и увеличението на телесното тегло. Анализите PERMANOVA и PERMDISP бяха извършени с Calypso. Стойностите на Р под 0,05 се считат за значими.

Резултати

Диетичен прием и тежести на плъхове

В това проучване плъховете са хранени с твърда диета без млечни продукти, за да премахнат потенциално объркващите ефекти на други млечни компоненти в диетата. Използваха се обезмаслено мляко на прах и млечните напитки се разреждат до 3% протеин, за да се изравнят приема на мазнини и протеини.

Плъховете във всички групи на лечение са имали среден дневен прием от 27 ± 3,5 g (SD) на твърда храна, а телесното тегло се е увеличило с 19 ± 3,9% (SD) за 14 дни (допълнителна таблица S3) (Dalziel et al., 2018). Няма значителна разлика между дневния прием на твърда храна или теглото на групата за лечение на ден 0 или 14 (допълнителна таблица S3). За млечните напитки групата CM (87,48 ml) е имала най-нисък среден дневен прием, а CY групата е била най-висока (103,73 ml), но разликата в приема между всички групи не е била статистически значима (ANOVA, p = 0,07) (Допълнителна таблица S3).

Cecal Microbiota се различава сред леченията с млечни напитки

За да се определи дали има разлики между четирите групи за лечение на млечни напитки, данните за последователността с висока производителност бяха анализирани за разнообразие, състав на общността, таксономия и корелации с метаданните. За да се разгледа алфа разнообразието, бяха определени индексите на Шанън. Не открихме значителни разлики между лечебните групи (допълнителна фигура S1).

След това определихме разлики в общия състав на бактериалната общност. Анализът на основния компонент на Bray-Curtis (PCA) не показва отчетливо разделяне между групите за третиране, а по-скоро разпределение, подобно на градиент, при третирането с краве мляко, показващо най-голямо разпространение между отделни плъхове (Фигура 1). За да се определи дали може да има значителна разлика между групите, беше извършен PERMANOVA, което предполагаше разлика между лекуваните групи (p Фигура 2. На ниво филум (Фигура 2A), групата с краве мляко (CM) се отличаваше особено с повишени актинобактерии и намаляват Bacteroidetes. Млякото (CM, SM) има сходни количества Firmicutes, докато киселите млека (CY, SY) съдържат сравними съотношения както на Firmicutes, така и на Bacteroidetes. При таксономична класификация на ниво семейство (Фигура 2B), таксономичните разлики в изобилието също могат може да се наблюдава при специфични лечения (напр. по-високи Coriobacteriaceae в CM) и между неферментирали и ферментирали продукти (напр. по-високи Lactobacillaceae в млека) .Разликата в вариациите в общността в рамките на общността, отбелязана от PERMDISP анализ, предполага по-висока таксономична вариабилност сред отделните плъхове в някои третирани групи (напр. CM) (по-малко еднороден таксономичен състав). Таксономични графики на отделни плъхове подчертават тези проби (Supplementar y Фигура S2).

ефектите

Таксономични графики, представящи (А) тип и (Б) бактериални съобщества на семейно ниво (средно за групата), открити във всяка група за лечение на млечни напитки [CM, краве мляко; CY, краве кисело мляко; SM, овче мляко; SY, овче кисело мляко].

За да идентифицираме стабилни и значими разлики в таксономичните изобилия между лечебните групи, избрахме да използваме LEfSe, за да идентифицираме таксономични групи със значителни разлики, вариращи от тип до OTU. LEfSe идентифицира 16 таксона със значителни промени (Фигура 3). Докато бяха идентифицирани редица таксони, подобно на графиките на таксономичния състав, лечението с млечни напитки CM очевидно имаше по-уникално таксономично представяне. Особено голямото му съдържание в Collinsella aerofaciens (OTU6) (Collinsella, Coriobacteriaceae, Coriobacteriales, Coriobacteriia, Actinobacteria) и по-ниското съдържание на Acidaminococcaceae (Selenomonadales, Negativicutes) липсват в другите групи млечни напитки.

Стълбовидна диаграма на таксономичните групи, посочени от LEfSe анализ, които най-вероятно обясняват разликите между видовете продукти (мляко срещу кисело мляко) (p Фигура 5). Докато шест таксона бяха идентифицирани като значително различни, по-голямата част от промяната може да бъде свързана с една OTU (C. aerofaciens, OTU6), което предполага по-малко влияние на видовия произход върху цялостната бактериална общност. Този таксон също е идентифициран в анализите на лечението и рода Collinsella в анализа на състоянието на ферментация, което предполага, че множество фактори влияят върху неговото изобилие.

Стълбовидна диаграма на таксономичните групи, посочени от LEfSe анализ, които най-вероятно обясняват разликите в произхода на продуктите (крава срещу овца) (p (10K, XLSX)