Резюме

Заден план

Западната диета и начин на живот са свързани с наднорменото тегло, затлъстяването и диабет тип 2, които от своя страна са свързани с процесите на невровъзпаление. Упражненията и здравословното хранене са важни за профилактиката на тези нарушения. Въпреки това, молекулите, инхибиращи невровъзпалението, също могат да бъдат ефикасни при профилактиката и/или лечението на неврологични разстройства с възпалителна етиология. Абсцизовата киселина (ABA) е фитохормон, участващ в реакциите на хидратен стрес. Това съединение се намира не само в растенията, но и в други организми, включително бозайници. При гризачите ABA може да играе благоприятна роля в регулирането на периферния имунен отговор и действието на инсулина. По този начин ние предположихме, че хроничното приложение на ABA може да упражни защитен ефект в модел на невровъзпаление, индуцирано от диета с високо съдържание на мазнини (HFD).

лечение

Методи

Мъжките плъхове Wistar са хранени със стандартна диета или HFD със или без ABA в питейната вода в продължение на 12 седмици. Извършен е тест за толерантност към глюкоза и поведенчески парадигми за оценка на периферните и централните ефекти на лечението. Извършена е еднопосочна ANOVA, анализирана статистическа разлика между групите.

Резултати

HFD индуцира инсулинова резистентност периферно и повишава нивата на провъзпалителни маркери в мозъка. Наблюдавахме, че ABA възстановява глюкозния толеранс при плъхове, хранени с HFD, както се очаква. В допълнение, хроничното лечение с ABA спасява когнитивните показатели при тези животни, като същевременно не засяга контролните диети, хранени с животни. Нещо повече, той противодейства на промените, индуцирани от HFD в хипоталамуса; активиране на микроглия и нива на иРНК на TNFα.

Заключение

Тези резултати предполагат, че ABA може да се превърне в нова терапевтична молекула, подобряваща невровъзпалителния статус и инсулиновата резистентност.

Заден план

Освен това ABA показва някои молекулярни структурни прилики с ретиноевата киселина (RA). RA има благоприятни когнитивни ефекти, коригирайки дефицитите на паметта при модели на гризачи на болестта на Алцхаймер. Данните от клиничните и животински модели обаче показват връзка между приложението на RA и симптомите на депресия [15]. Хроничното лечение с ABA има благоприятни антидепресантни ефекти, демонстрирани от увеличен прием на захароза, повишено плуване в теста за принудително плуване и намалена експресия на CRH и RARα mRNA в хипоталамуса на плъхове при контролни плъхове, без докладвани странични ефекти [16]. Освен това предварителните данни показват подобрена пространствена памет при плъхове, лекувани с ABA [17]. Въз основа на тези данни ние предположихме, че тъй като ABA може да модулира периферна инсулинова резистентност и имунен отговор, той може също да упражнява подобно действие централно. По този начин, тази работа има за цел да покаже дали диетичният ABA би могъл да възстанови когнитивните дефицити в резултат на невровъзпаление, индуцирано от високо съдържание на мазнини (HFD). HFD повишава нивата на маркерите за невровъзпаление в мозъка [18] и може да представлява връзка между затлъстяването и дегенеративните разстройства чрез инсулинова резистентност [19]. Освен това е доказано, че HFD предизвиква загуба на паметта чрез повишаване на възпалителни маркери в хипокампуса [20].

Приложихме ABA (20 mg/L) в питейната вода на плъхове или с HFD, или със стандартна диета (SD). След единадесет седмици лечение сравнихме поведението на четирите групи, използвайки две парадигми на паметта: разпознаването на новия обект (NOR) и Т-лабиринта. Освен това измерихме нивата на ABA в кръвта и малкия мозък и на четирите групи, използвайки HPLC. Ние анализирахме пролиферацията на микроглията с помощта на имунохистохимия. Демонстрирахме, че ABA, прилаган в питейна вода, подобрява глюкозния толеранс и когнитивните показатели и намалява нивата на възпалителни маркери в хипоталамусните области. Нашите резултати потвърждават терапевтичния потенциал на този фитохормон в периферните метаболитни промени. Данните също така категорично предполагат потенциалните благоприятни ефекти на ABA при нарушения на невровъзпалителната етиология, което не е демонстрирано преди.

Методи

Целта на експеримента е да се оценят централните ефекти на фитохормона, ABA в модел на невровъзпаление, предизвикано от HFD, по време на 12-седмично лечение. Тестовете за поведение започнаха на 11-та седмица и жертвите бяха извършени през 12-та седмица на ABA и диетично лечение (Фиг. 1).

Експериментален дизайн. Тестовете за поведение започнаха през 11-та седмица и животните бяха жертвани през 11-та и 12-та седмица

Животни и диета

Разпознаване на нов обект (NOR)

Т-лабиринт

Т-лабиринтът беше лабиринт с три ръце; едната ръка (119,3 × 18,2 см) е по-дълга от другите две, които са идентични (21,1 × 34,5 см); целият лабиринт беше поставен над пода. За стартово рамо беше избрано по-дългото рамо. Плъховете бяха привиквани в стаята за поведение в продължение на 30 минути. В тестовия ден животните бяха оставени да изследват лабиринта за 5 минути, с достъп до две от трите рамена (началната или стартовата ръка и познатата ръка). След това плъхът беше върнат в домашната си клетка за 2-часов интервален интервал (група с трудна задача) или 90-минутен интервал (група за лесни задачи), по време на който лабиринтът беше почистен с 30% етанол. След това плъхът беше поставен обратно в лабиринта; този път животното имаше достъп до всички оръжия за 5 минути [24]. Броят на влизанията в новата ръка и времето, прекарано във всяка ръка, се записва с помощта на система за видео проследяване (Smart 2.5.19).

Тест за толерантност към глюкоза

Плъховете се гладуват през нощта и капка кръв се взема от опашката преди (t = 0) и 30 минути (t = 30) и 120 минути (t = 120) след приложение на глюкоза (2 g/kg). Плазмената глюкоза беше измерена с помощта на глюкометър Glucomen LX Plus.

HPLC ABA измервания

ABA беше анализиран във всичките четири групи, използвайки LC/ESI-MSMS, по същество, както е описано в [25], с леки модификации. Накратко, 1 g замразена тъкан се екстрахира в ултрачиста вода с помощта на тъканен хомогенизатор (Ultra-Turrax, Ika-Werke, Staufen, Германия) след добавяне на 100 ng от д 6 -ABA. След екстракция и центрофугиране, рН на супернатанта се регулира на 3.0 и се разделя два пъти срещу диетилов етер (Panreac, Барселона, Испания). Органичните слоеве се комбинират и се изпаряват във вакуумен изпарител за центрофуги (Jouan, Saint-Herblain, Франция). След това сухият остатък се суспендира отново във разтвор вода-метанол (9: 1), филтрира се и се инжектира в система UPLC ™ Acquity (Waters, Milford, MA, USA). След това аналитът се разделя на UPLC C18 колона с обърната фаза (Nucleodur C18, 1.8 μm, 50 × 2.0 mm, Macherey-Nagel, Барселона, Испания). Разтворителите бяха метанол и вода, допълнени с 0,01% оцетна киселина, приложени при скорост на потока 300 μL min -1. ABA е количествено определена с Quattro LC троен квадруполен масспектрометър (Micromass, Waters, Manchester, UK), свързан онлайн към изхода на колоната чрез ортогонален източник на йон с електроспрей Z-спрей. Количественото определяне на този хормон е постигнато чрез външно калибриране с известни количества стандарти.

Имуноцитохимия (ICC)

Плъховете бяха анестезирани с предозиране на пентобарбитал (120 mg/kg Eutanax, Fatro, Барселона, Испания) и транскардиално перфузирани с физиологичен разтвор (0,9%), последвано от 4% фиксатор на параформалдехид (PFA) в 0,1 М фосфатен буфер, рН 7,4. След перфузията мозъците се отстраняват от черепите и се фиксират през нощта при 4 ° C в PFA. След това мозъците бяха потопени в 30% захароза в продължение на 48 часа за криозащита. Плъзгащият се Microtome Leica SM2010R (Leica Microsystems, Хайделберг, Германия) беше използван за получаване на замразени коронални участъци с дебелина 40 μm. Мозъците бяха нарязани в рострокаудална посока; шест серии резени бяха събрани от всеки мозък и съхранени при -20 ° C за анализ.

Екстракция на РНК и RT-PCR

Резултати

Животните се претеглят и консумацията на вода и храна се наблюдава два пъти седмично. Тестовете за поведение започнаха на 11-та седмица и жертвите бяха извършени през 12-та седмица на ABA и диетично лечение (Фиг. 1). Както се очаква, прекомерното хранене се отрази на телесното тегло, но приложението на ABA не повлия на наддаването на тегло и в двете групи. Резултатите са представени като средните стойности ± SE (н = 16 на група). Контролните животни, хранени със SD, увеличават телесното си тегло от 444 ± 11,7 g (седмица 1) на 585 ± 12,0 g (седмица 10). По същия начин животните на SD, допълнени с ABA, увеличиха телесното си тегло от 446 ± 10,7 g (седмица 1) на 593 ± 10,2 g (седмица 10). Това представлява увеличение от 132 ± 2,4% и 133 ± 1,5%, съответно за SD и SD с ABA. Въпреки това, животните, хранени с HFD и HFD-ABA, увеличават телесното си тегло от 448 ± 11,7 и 453 ± 12,2 g (седмица 1) на 659 ± 16,0 и 669 ± 16,2 g (седмица 10), увеличение от 148 ± 3,2% и 148 ± 2,8%, съответно (фиг. 2а). Данните бяха анализирани с помощта на двупосочен ANOVA; време (F (10 600) = 994, стр Фиг. 2

Съобщава се, че диетичният ABA, приложен в хранителните гранули (100 mg/kg храна), може да подобри глюкозния толеранс [21]. За да потвърдим, че в нашия модел ABA (20 mg/L питейна вода) подобрява хомеостазата на глюкозата, направихме тест за толерантност към глюкоза чрез интраперитонеално инжектиране на глюкоза (2 mg/kg) при гладни животни. След 11 седмици лечение животните гладуват цяла нощ (12–13 часа). Базалните нива на глюкоза са сходни във всички групи; 30 минути след инжектиране на глюкоза, нивата на кръвната захар се повишават. Не са наблюдавани значителни разлики между групите. Въпреки това, два часа след инжектирането, нивата на глюкоза в групата с HFD остават по-високи (235,4 ± 36 mg/dL), отколкото в групата с HFD-ABA (158,9 ± 11,23 mg/dL). В последната група нивата на глюкозата са подобни на тези в контролните групи SD (143,9 ± 10,24 mg/dL) и SD-ABA (152,6 ± 15,52 mg/dL). Данните бяха анализирани с помощта на еднопосочен ANOVA, с тест Newman – Keuls post-hoc (стр Фиг. 3

HFD може да предизвика нарушения на паметта при гризачи [26] и хора [27]. За да се изследва ефектът от хроничното приложение на ABA върху когнитивните показатели, животните са били подложени на две поведенчески парадигми, които оценяват паметта при гризачи, NOR и T-лабиринт тест. NOR използва вроденото предпочитание за проучване на нови предмети, изложени от гризачи. Тази парадигма изследва способността на животното да запомни познат обект, когато му бъде представен нов. Не наблюдавахме значителни разлики във времето, прекарано в проучване на идентичните обекти по време на фазата на запознаване (Фиг. 4а и в). По време на теста и четирите групи прекарват много повече време в проучване на новия обект, отколкото познатия, и нито диетата, нито лечението с ABA променят тези параметри (фиг. 4б). Наблюдавахме обаче разлики, когато времето за запознаване и времето за изпитване бяха намалени до 3 минути. В HFD групата времената за познат и нов обект не се различават съществено, което предполага нарушение в запомнянето на познатия обект. Животните с HFD-ABA се държаха по същия начин като контролните групи (SD и SD-ABA), което показва, че ABA може да отмени индуцираното от HFD увреждане (Фиг. 4г).

В теста за Т-лабиринт регистрирахме броя на влизанията в двете лабиринтни ръце, единият от които беше познат, а другият беше нов, тъй като беше затворен по време на привикването. Забелязахме, че плъховете, хранени със SD, SD-ABA и HFD-ABA, имат значително по-голям брой влизания в новото рамо, отколкото в познатото. Това не е така при животните, хранени само с HFD, което предполага, че тази диета може да наруши паметта на познатата ръка (фиг. 5а). Данните бяха анализирани с помощта на несдвоени Student’s т-тест, сравняване на позната и нова ръка; *стр Фиг. 5

Нивата на ABA в кръвта и мозъка (малкия мозък) бяха измерени с помощта на HPLC. Открихме променливи количества циркулираща ABA при третирани животни. Въпреки това не успяхме да открием ABA при същите условия при нелекувани животни, потвърждавайки, че наистина наблюдаваме екзогенен ABA (Таблица 2). Съобщава се, че след интраперитонеални инжекции ABA се разпространява широко в мозъка [17]. За да установим, че ABA преминава кръвно-мозъчната бариера в нашия модел, ние измерихме нивата на ABA в малкия мозък като контролен. Подобно на изследването на серума, ABA се открива само в мозъка на лекувани животни (Таблица 2). Интересното е, че само много малка част от циркулиращата ABA преминава кръвно-мозъчната бариера. По този начин потвърдихме, че нашият метод за приложение на ABA в питейна вода е подходящ за измерване на потенциални периферни ефекти; съединението може да премине мозъчно-кръвната бариера и може да е отговорно за наблюдаваните поведенчески промени.

След това измерихме нивата на възпалителни маркери в мозъка. Използвахме имунохистохимия, за да открием специфичния за микроглията цитоплазмен маркер Iba1 [28] в хипоталамуса (фиг. 6а). Наблюдавахме, че броят на микроглиалните клетки се увеличава значително в хипоталамуса на плъхове при плъхове, хранени с HFD (1613 ± 260,5 клетки/mm 2) в сравнение с контролите, хранени със SD (754 ± 135,2 клетки/mm 2). Лечението с ABA намалява този ефект при HFD животни (888 ± 158,8 клетки/mm 2), но не засяга SD-хранени животни (794 ± 178,4 клетки/mm 2) (Фиг. 6b; еднопосочен ANOVA, стр = 0,0135). Представителни изображения на микроглията в хипоталамуса са показани на фиг. 6 (HFD, фиг. 6в; HFD-ABA, фиг. 6d; SD, фиг. 6д; и SD-ABA, фиг. 6е). В групата с HFD, освен увеличаването на броя на Iba1-положителните клетки, клетките на микроглията са по-малко разклонени и по-амебоидни, отколкото в контролите, което показва активирано състояние (вложки в изображения).

След това изследвахме нивата на възпалителни и противовъзпалителни цитокини в хипоталамуса. Хипоталамусът се дисектира от всички групи и се изолира общата РНК. Проведена е количествена PCR, за да се определят нивата на експресия на различни цитокини. Наблюдавахме, че нивата на TNF-α се повишават в хипоталамуса на плъхове, хранени с HFD, в сравнение с контролите, потвърждавайки съществуващите доклади [29, 30]. Администрацията на ABA възстановява нивата на TNFα до контролни стойности (фиг. 7). От друга страна, не открихме значителни разлики в хипокампуса, при еднакви условия във всичките четири групи (данните не са показани).

Дискусия

Прекомерният прием на енергия е основна причина за затлъстяването, което е признато за една от най-големите заплахи за човешкото здраве в западните общества. Неизправността на хипоталамусните неврони изглежда е в основата на патологията на метаболитните заболявания [31]. Въпреки че връзката между затлъстяването (излишните телесни мазнини) и невродегенерацията е силно сложна, много източници свързват затлъстяването и високата консумация на мазнини с определени невродегенеративни процеси [19]. Нарастващите доказателства показват, че HFD предизвиква инсулинова резистентност, имунологични и синаптични промени в различни мозъчни области [32, 33] и когнитивно увреждане [34].

При модели на затлъстяване при животни фитохормонът ABA, свързан структурно със сенсибилизатори на инсулин (TDZ) и молекули за подобряване на паметта (като ретиноева киселина), подобрява симптомите на диабет тип 2. Той е насочен към PPAR-γ по начин, подобен на TDZ клас антидиабетни лекарства [21, 35]. В това проучване ние за първи път демонстрираме, че ABA може да противодейства на някои от неврологичните ефекти (когнитивни увреждания и маркери за невровъзпаление), индуцирани от HFD. Ние, в това проучване и други открихме, че ABA може да премине кръвно-мозъчната бариера, но дали подобрението на когнитивните функции е причинено от прякото действие на ABA в мозъка, остава неуловимо.

При NOR тест за работна памет всички групи, включително HFD групата, успяха да различат между романа и познатия обект. Въпреки това, когато времето, прекарано във фазите на запознаване и изпитване, беше съкратено, като по този начин намалява/наранява фазата на придобиване, хранените с HFD животни прекарват подобно време в проучване на романа и познатия обект. Това показваше, че вече не си спомнят познатия обект. Това поведение е ефективно противодействано чрез лечение с ABA. Третираните с ABA животни се държаха като членовете на други групи, прекарвайки значително повече време в проучване на новия обект.

Освен това, за да тестваме противовъзпалителните ефекти на ABA в централната нервна система, измерихме нивата на хипоталамуса и хипокампалния цитокин. Активираните микроглии синтезират и секретират възпалителни цитокини, като TNFα [60]. Наблюдавахме повишаване на нивата на TNFα в хипоталамуса на плъхове, хранени с HFD. Лечението с ABA спаси този ефект, намалявайки TNFα до контролни нива. Противно на други проучвания, при които е установено, че маркерите на възпалението се увеличават в хипокампуса, не установихме значителна разлика във възпалителните маркери TNF-α при лечение с HFD в сравнение с контролните групи. Ние постулираме, че не само хипокампалната невро възпаление е в основата на когнитивните увреждания.

Заключение

В обобщение установихме, че хроничното лечение с ABA намалява HFD-индуцирана активация на микроглия в хипоталамуса, както се разкрива от оцветяването с Iba-1. Също така, нивата на TNF-a бяха променени в хипоталамуса на животни, хранени с HFD, и тези промени бяха противодействани от приложението на ABA. Освен това ABA подобрява индуцираните от HFD увреждания в когнитивните показатели. Не открихме промени в невровъзпалителните маркери в хипоталамуса. В това проучване ние показваме, че възпалението на хипоталамуса може да корелира с леки промени в когнитивните показатели. И накрая, въз основа на нашите резултати, заключаваме, че ABA има защитен ефект при невровъзпалителни състояния, намалявайки нивата на микроглията и TNFα и възстановявайки когнитивната функция. Предвид факта, че ABA може да премине кръвно-мозъчната бариера; ние постулираме, че тази молекула може да има потенциална терапевтична стойност при лечението на заболявания с невро-възпалителна етиология.