Резюме

Заден план

Ограничаването на вътрематочния растеж (IUGR) и свръхрастежът на плода увеличават рисковете за здравето след раждането. Храненето на майката е основният вътрематочен фактор на околната среда, който променя теглото на плода. Механизмите, залегнали в основата на ефектите от храненето на майката върху развитието на плода, не са напълно ясни. Разработихме модел на свине и използвайки изобарни маркери за относително и абсолютно количествено определяне (iTRAQ), изследвахме промени в плацентарния протеом на свинете при диета с нормален енергиен прием (Con) и висок енергиен прием (HE).

Резултати

В групата Con бяха открити тежки и леки плодове в тръбните и цервикалните краища на матката, съответно на 90 d бременност. Нещо повече, тежките плодове имат по-висока концентрация на глюкоза от леките плодове. По-висока еднородност обаче е отбелязана в групата на ВО. Плацентарните промотори между тези две позиции показват, че 78 и 50 диференциално експресирани протеини са открити съответно в групите Con и HE. В групата Con тези протеини участват в липидния метаболизъм (HADHA, AACS, CAD), транспорта на хранителни вещества (GLUT, SLC27A1) и енергийния метаболизъм (NDUFV1, NDUFV2, ATP5C1). Въпреки това, в HE групата те са участвали главно в транскрипционна и транслационна регулация и вътреклетъчен везикуларен транспорт.

Заключения

Нашите открития разкриха, че храненето на майката може да промени теглото при раждане главно чрез модулация на плацентарния липиден и енергиен метаболизъм, което също така предоставя възможен механизъм за обяснение на по-голямата еднородност на феталното тегло при свинете, хранени с диета с високо съдържание.

Заден план

В сравнение с овцете и гризачите, прасетата са по-сходни с хората физиологично и генетично [11] и следователно се разглеждат като идеален модел за изследване на клиничното хранене [12]. Някои проучвания с модели на свине показват, че отрицателният ефект от ненормалния растеж на плода е, че той допринася за по-голяма вариация на теглото при раждане на прасенце (CVBW0) в рамките на постелята [13]. Интересното е, че Kim et al. (2013) обобщават, че теглото на плода нараства линейно от шийката на матката до маточно-тръбната връзка на 102 и 112 ден от бременността [14]. По този начин, използвайки модел на прасе, изследването на ефективността на плацентата, която е разположена от двете страни на маточния рог, вероятно ще отразява основните механизми на развитието на плода, които са от значение за честотата на IUGR и потомството с наднормено тегло. Новородените с твърде ниско или високо тегло при раждане са често срещан проблем в човешкото здраве, въпреки че хората обикновено принадлежат към класификацията на еднородните животни [15].

Повечето проучвания с животни показват, че приемът на храна от майката по време на бременността влияе върху теглото при раждане [16, 17]. Въпреки това механизмите, залегнали в основата на процесите, чрез които храненето на майките регулира развитието на плода, остават неясни. Следователно, това проучване изследва молекулярната основа на вариациите в новороденото тегло, причинени от променливите нива на енергиен прием на майката по време на бременността. Използвайки свински модел, ние изследвахме свързаните фактори, използвайки плацентни протеомни анализи с изобарни маркери за относително и абсолютно количествено определяне (iTRAQ). Нашите резултати ще предложат нова представа за по-добро разбиране на молекулярната основа на хранителната регулация на майката за развитието на плода чрез плацентата.

Методи

Управление на животните и експериментален дизайн

Проучванията върху животни са проведени в съответствие със закона за защита на животните, одобрен от Комитета за грижа и употреба на селскостопанските животни на Сечуанския земеделски университет. В този експеримент са използвани 28 чистокръвни Големи бели свине със средно тегло 135,54 ± 0,66 кг. След чифтосването свинете бяха разпределени на случаен принцип в две експериментални групи. Диетичните процедури включват две хранителни нива на захранване с различни концентрации на добавка от соево масло: 14,23 MJ DE/kg (HE) и 12,56 MJ DE/kg (Con) от препоръчителните енергийни изисквания от NRC (2012) (Таблица 1) . Приемът на фураж от гестационните свинки е бил 2,0 kg/d от d 0 до 30, 2,4 kg/d от d 31 до 90 и 3,0 kg/d от d 91 до опороса. Всички свинки бяха настанени в отделни хранилища за хранене и водата беше осигурена по желание.

Вземане на проби

Измерва се дебелината на задните мазнини на позлатните нерви (P2: 65 mm от средната линия на последното ребро). От всяка група бяха избрани на случаен принцип четири свинки, които да бъдат заклани съответно на d 55 и 90 от бременността, след дълбока анестезия със Zoletil 50 (Zoletil 50 Vet, Virbac, Франция), в доза от 0,1 mg/kg телесно тегло, приложена от интрамускулно инжектиране, останалите свинки са хранени до раждането. След лапаротомия матките незабавно бяха отстранени от позлата и поставени върху лед. На 90-ия ден от бременността от всеки плод се събира пъпна венозна кръв, която е разположена към маточната шийка и маточно-тръбната връзка. Всички кръвни проби се центрофугират веднага след събирането (3000 × ж за 15 минути при 4 ° С). За бъдещи анализи серумни проби бяха събрани и съхранявани при -20 ° C. Теглото на плодовете, разположени във всеки маточен рог, от шийката на матката до маточно-тръбната връзка, са записани на d 55 и 90 от бременността. Плацентите бяха внимателно изолирани и претеглени от матката на всеки плод на d 55 и 90 от бременността. На d 90 от бременността пробите от плацентарната тъкан, които заобикаляха шийката на матката и маточно-тръбната връзка, бяха замразени бързо в течен азот, след изплакване със студен стерилен физиологичен разтвор, за по-късни експерименти.

Анализ на серумен IGF-1 и глюкоза

Серумен IGF-1 и глюкоза бяха измерени с помощта на комплекти за имуносорбентен анализ (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA), в съответствие с препоръките на производителя. Минималните откриваеми нива на IGF-1 и глюкоза са 0,01 ng/mL.

Приготвяне на протеинова проба

майката

Количествен iTRAQ протеомичен подход. Тази фигура описва различното местоположение на плацентарното събиране на проби в матката между Con групата и HE групата. И основният процес на iTRAQ протеомичния подход

Анализи за протеомика на плацентата

LC-ESI-MS/MS анализ, базиран на Triple TOF 5600

Протоколът за MS анализ беше както е описано по-рано от [22] с леки модификации. Първо, всяка фракция беше ресуспендирана в буфер А (5% ACN, 0,1% FA) и центрофугирана при 20000 × ж за 10 минути и крайната концентрация на пептида е около 0,5 μg/μl. Впоследствие 10 μl от супернатанта се зареждат в 2 cm C18 уловител на колонна LC-20 AD nanoHPLC помпена система (Shimadzu, Киото, Япония). Пептидите се елуират върху 10 cm аналитична колона С18 (вътрешен диаметър 75 μm), опакована вътрешно. Пробите се зареждат при 8 μL/min за 4 минути, след това градиентът започва при 300 nL/min, от 2 до 35% B (95% ACN, 0,1% FA) за 35 минути, линеен градиент до 60% за 5 минути, 80% за 2 минути, поддръжка за 4 минути и накрая се върна до 5% за 1 минута. Фракциите бяха анализирани с помощта на система TripleTOF 5600 (AB SCIEX, Concord, ON) с източник Nanospray III (AB SCIEX, Concord, ON) и издърпан кварцов връх като излъчвател (New Objectives, Woburn, MA). Данните бяха получени за 250 ms и бяха събрани до 30 сканирания на йони на продукта, ако беше превишен праг от 120 броя в секунда (броя/s), с 2+ до 5+ състояние на зареждане и 15-s динамично изключване настройка. Всяка фракция се анализира от нано LC-MS/MS, както е описано по-рано от [23].

Обработка на данни и анализи

MRM валидиране на диференциално експресирани протеини от iTRAQ

Спектрална библиотека от данни за MS/MS беше генерирана на TripleTOF5600 (AB SCIEX, Фостър Сити, Калифорния) и търсена срещу база данни за свине (48278 записа) с помощта на Mascot 2.3.02 (Matrix Science, UK). Файлът с датата е импортиран в софтуера Skyline, където е изградена библиотека. Пептидите бяха избрани за разработване на метод за наблюдение на множество реакции (MRM) съгласно следните критерии: (1) пептидите с уникални последователности в базата данни; (2) максимум m/z 5 y-йони със същия профил на елуиране са в същите съотношения като спектралната библиотека. Прогнозираното време на задържане на целевите пептиди се наблюдава с IRT стратегия. Събраните пептиди се усвояват и се използва предварителен SRM анализ, за ​​да се определи къде са открити тези протеини.

Статистически анализ

Резултатите от репродуктивните показатели и данните за серумни биохимични показатели бяха анализирани с помощта на Student’s т-тест в SPSS (v. 19.0 за Windows, SPSS; IBM SPSS Company, Чикаго, IL, САЩ). Вариациите в теглото при раждане на плода и прасенцата бяха анализирани след трансформация на арсинус в квадратни корени. Резултати с стр

Резултати

Репродуктивни показатели на свинете

Диетичното лечение на майката няма ефект върху дебелината на задните мазнини в позицията P2, теглото на плода и коефициента на вариация на теглото (CVweight) на 55-ия ден от бременността (Таблица 2; стр > 0,05). Въпреки това, на 90-ия ден от бременността, свинете са имали по-висока дебелина на задната мазнина в позицията P2 в HE групата, отколкото Con групата (стр Таблица 2 Влияние на диетичното енергийно ниво върху репродуктивните способности на свинете

Разпределение на теглото на плода и плацентата (ж) в рамките на маточния рог. а: разпределение на феталните тегла в Con групата на 55-ия ден от бременността; б: разпределение на плацентарните тегла в Con групата на 55-ия ден от бременността; ° С: разпределение на феталните тегла в групата на ВО на 55-ия ден от бременността; д: разпределение на плацентарните тегла в HE групата на 55-ия ден от бременността; д: разпределение на феталните тегла в групата Con на 90-ия ден от бременността; е: разпределение на плацентарните тегла в групата Con на 90-ия ден от бременността; ж: разпределение на феталните тегла в групата на ВЕ на 90-ия ден от бременността; з: разпределение на плацентарните тегла в групата на ВЕ на 90-ия ден от бременността. Данните са представени като медиана (интерквартилен диапазон)

Концентрации на IGF-1 и глюкоза в серум на плода на различни места в матката

На 90-ия ден от бременността концентрациите на IGF-1 и глюкоза в групата Con са били значително по-високи при плодовете, разположени към маточно-тръбната връзка, отколкото тези към шийката на матката (стр 0,05) (Таблица 3; Допълнителен файл 2: Таблица S2).

Идентифициране и сравнение на протеини с диференциално изобилие

С помощта на iTRAQ анализ бяха идентифицирани общо 3011 и 3018 протеини в рамките на степента на фалшиво откриване от 1% в различни маточни местоположения съответно на групите Con и HE (Допълнителен файл 3: Таблица S3; Допълнителен файл 4: Таблица S4).

От идентифицираните протеини в групата Con, 78 показват> 1,2-кратни промени между шийката на матката и маточно-тръбната връзка (стр Таблица 4 Диференциално експресирани протеини в плацентата в групата Con

Функционална класификация на протеини с диференциално изобилие, идентифицирани от плацентата. Панелите показват представителни цифри, получени от а: групата Con и б: група ВО

От идентифицираните протеини в групата на НЕ, 50 показват> 1,2-кратни промени между шийката на матката и маточно-тръбната връзка (стр Таблица 5 Диференциално експресирани протеини в плацентата в HE групата

GO анотации на протеини с диференциално изобилие

GO анализ на разпределението на диференциално експресирани протеини в плацентата. а: "клетъчният компонент" на Con групата; б: "клетъчният компонент" на НЕ групата; ° С: "молекулната функция" на Con групата; д: "молекулната функция" на НЕ групата; д: "биологичният процес" на Con група; е: „биологичният процес“ на НЕ групата

MRM валидиране за диференциално експресирани протеини от iTRAQ

MRM анализът успешно открива 10 диференциално експресирани протеина (Таблица 6), включително общо 20 уникални пептида от iTRAQ. Важно беше, че логарифните съотношения на количествените данни за 10-те целеви протеини от MRM бяха значително положително корелирани с тези от iTRAQ (Фиг. 5; стр 1.2, стр Таблица 6 MRM валидиране на диференциално експресирани протеини в Con и HE групи

Корелацията на гъвкавата промяна между iTRAQ и MRM за десетте целеви протеина. а: корелацията на Con групата; б: корелацията на групата на ВО

Дискусия

Диференциално изследване на протеома между плацентата към позицията на шийката на матката и маточно-тръбната връзка в Con група

Диференциално изследване на протеома между плацентата в позицията на шийката на матката и маточно-тръбната връзка в групата на HE

Заключение

Нашето проучване предоставя първите доказателства за промяна в отговора на протеомите в маточно-тръбния и цервикалния край на плацентата на повишен хранителен енергиен прием при позлата. Плацентарният метаболизъм на липидите и енергията и транспортирането на хранителни вещества могат да бъдат от решаващо значение за влиянието върху теглото на плода. В допълнение, това проучване демонстрира, че високоенергийното снабдяване по време на бременността подобрява развитието на плода, подобрява снабдяването с плацентарни хранителни вещества и намалява варирането на теглото при раждане в рамките на постелята, в крайна сметка, увеличавайки теглото на плода и еднородността на теглото при раждане на прасенца. Тези открития предоставят нова представа за механизмите, чрез които майчиното хранене регулира растежа на плода и подобрява нашето разбиране за ефективността на плацентата.