Етнофармакология

Редактиран от
Ruixin Zhu

Университет Тонджи, Китай

Прегледан от
Houkai Li

Шанхайски университет по традиционна китайска медицина, Китай

Лукинг Джао

Пекинска болница за традиционна китайска медицина, столичен медицински университет, Китай

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

билкова

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Институт за изследване на мозъка и червата, Училище по китайска медицина, Хонконгски баптистки университет, Хонконг, Хонконг
  • 2 YMU-HKBU Съвместна лаборатория по традиционна природна медицина, Университет Юнан Миндзу, Кунмин, Китай
  • 3 Център за клинично изследване на китайската медицина в Хонг Конг, Хонконгски баптистки университет, Хонконг, Хонг Конг

Въведение

Функционалният запек (FC) засяга над 14% от възрастните в световен мащаб (Suares и Ford, 2011). Жените, възрастните хора или хората с по-нисък социално-икономически статус са по-склонни да бъдат засегнати от FC (Suares и Ford, 2011). FC значително влияе върху качеството на живот на пациентите и причинява тежка обществена тежест (Liem et al., 2009; Peery et al., 2012; Peery et al., 2015). Пациентите с лек или умерен FC могат лесно да бъдат лекувани с храни с високо съдържание на фибри или лаксативи (Rao et al., 2015; Christodoulides et al., 2016), докато тези с тежък FC изискват специални грижи и въздействащи лечения, включително антрахинон, дифенил метани или производни, агонист на 5-хидрокситриптамин рецептор 4, агонист на рецептор на гуанилат циклаза С, активатор на хлориден канал тип 2, апикални инхибитори на натриевата жлъчна киселина и др. (Nelson et al., 2016). Повече от 50% от пациентите с ФК не са напълно доволни от настоящите си терапии (Nelson et al., 2016), поради което са необходими алтернативни подходи за лечение.

Насърчаването на клиничните резултати доведе до разработването и провеждането на фармакометаболомен анализ и фармакологично проучване. Фармакометаболомиката включва картографиране на лекарствените ефекти върху метаболизма и идентифициране на пътища, които допринасят за ефикасността на лекарството и/или нежеланите лекарствени реакции (Kaddurah-Daouk и Weinshilboum, 2014). Анализирайки пробите от серума преди и след лечението от 85 пациенти с FC, които бяха произволно избрани от групите с три ръце в клиничното проучване с три ръце, установихме, че представителен метаболит, идентифициран като олеамид, е силно свързан с чревната подвижност. Промяната на серумния олеамид значително корелира с пълното подобрение на спонтанното движение на червата (CSBM) в групата на MZRW, но не и с подобрението на CSBM в групата на Senna или плацебо. Това предполага, че сигнализирането за олеамид може да бъде специално насочено от MZRW за облекчаване на FC. След това се изследва как олеамидът се регулира от MZRW при пациенти с FC и мишки.

Материали и методи

Участници

Участниците бяха допустими съгласно публикувания протокол (Zhong et al., 2013) и клинично проучване (Zhong et al., 2019). Накратко, субектите бяха включени, ако бяха изпълнени следните изисквания: 1) диагностициран с FC според Рим III; 2) диагностициран с прекомерен модел според TCM; 3) на 18-65 години; 4) пълно спонтанно изхождане (CSBM) ≤ 2 пъти седмично; 5) тежест на запека ≥ 3 точки (по 7-степенна скала) (Ford и Suares, 2011); 6) общ резултат на симптомите ≥ 8 точки (по 7-степенна скала за симптоми, свързани със запек); 7) нормално изследване на дебелото черво (бариева клизма или колоноскопия) в рамките на пет години; 8) нормална чернодробна и бъбречна функция при кръвен тест в рамките на 3 месеца. Субектите бяха изключени, ако имаха 1) вторичен запек; 2) тежки заболявания; 3) претърпяла коремна операция в рамките на една година; 4) история на алергия към китайска билкова медицина; 5) психиатрични или пристрастяващи разстройства, изискващи лекарства със странични ефекти на запек. Бременни или кърмещи жени също бяха изключени. CSBM е избран като основна крайна точка на ефикасност. Крайният брой пациенти, включени от различна интервенционна група в това проучване, е: MZRW, 30; Сена, 31 г .; плацебо, 24.

Подготовка на гранули MZRW за интервенция на пациента на FC

Приготвяне на екстракт от MZRW за проучване върху животни

Приготвянето на екстракта MZRW беше подобно на предишното проучване (Huang et al., 2018). Канабис Фруктус (892,9 g), Rhei Radix et Rhizoma (446.4g), Армения Семен Амарум (446,4 g), Paeoniae Radix Alba (223,2 g), Magnoliae Officinalis Cortex (267,9 g) и Aurantii Fructus Immaturus (223,2 g) се смесват и се декорират с 8-наводнени обеми вода (1: 8, w/v) в продължение на 2,5 h. След това отварата се прецежда. Концентрирана отвара се приготвя чрез ротационно изпаряване под вакуум при 55 ° С. Остатъкът беше лиофилизиран. Накрая изсушеният остатък се разтваря във вода, за да се получи орален разтвор с концентрация 0,5 g/ml. Суровините се съхраняват при стайна температура, докато препаратите MZRW се съхраняват при -20 ° C. Пълният химичен състав на екстракта MZRW беше идентифициран чрез UPLC-Q-TOF-MS (Таблица S3). Основните съединения на екстракта MZRW са количествено определени чрез LC-MS: амигдалин (9,91 ± 0,55 mg/g), албифлорин (0,70 ± 0,07 mg/g), паеонифлорин (1,37 ± 0,07 mg/g), нарингин (0,70 ± 0,06 mg/g), хесперидин (12,23 ± 0,46 mg/g), алое емодин (1,61 ± 0,11 mg/g), реин (17,72 ± 1,46 mg/g), емодин (6,51 ± 0,30 mg/g), хонокиол (7,23 ± 0,09 mg)/g) и магнолол (1,30 ± 0,10 mg/g).

Нецелево профилиране на серумна метаболомика

Количествен анализ на олеамид в проби

Екстракция на олеамид

Процедурата за екстракция на олеамид в образци е подобна на тази от предишно проучване (Schreiber et al., 2007). Накратко, 200 μL обем ацетон се смесва с 200 μL серум и претеглените тъкани (50 mg) се хомогенизират с петкратен обем ацетон за утаяване на протеини. След центрофугиране при ниска температура (12000 rpm за 10 минути), супернатантите се събират и се сушат под поток от азот. Впоследствие олеамидът се екстрахира със смес от хлороформ и метанол (2: 1, v/v) и хлороформните фази се изпаряват до сухо под азот, разтварят се в ацетонитрил и накрая се прехвърлят в епруветки за вземане на проби за допълнителен LC-MS анализ.

LC-MS Инструментални условия

Детекцията се провежда с помощта на течна хроматография (Agilent LC 1290, САЩ), куплирана с три-квадруполен масспектрометър (Agilent QQQ-MS 6438, САЩ) в положителен ESI режим с мониторинг на множество реакции (MRM). 5 µL от всяка проба се инжектират върху UPLC BEH C18 колона и се елуират, като се използва линеен градиент на дейонизирана вода (A) и ацетонитрил (B) със следната програма: 70% до 100% B за 4,5 минути, държана при 100% B за 2 минути, отново уравновесен при 70% В за 4 минути. Изследваните метаболити, заедно с техните специфични MRM преходи, MS/MS параметри и нейната йонна хроматография са показани в Таблица S4.

Проучване върху животни

MZRW лечение при индуцирана от олеамид бавна чревна подвижност при мишки

Мъжки мишки C57BL/6J с тегло 22-25 g са закупени от Центъра за лабораторни услуги за животни, Университета в Хонг Конг. Животните бяха хранени с нормална храна за гризачи ad libitum със свободен достъп до вода и бяха настанени в помещения, поддържани при 22 ± 1 ° C с 12-часов цикъл светлина/тъмнина (светлини в 6: 00-18: 00). 32 мишки бяха разделени по равно на 4 групи. Индуцираният от олеамид модел на бавна чревна подвижност при мишки е подобен на този, както в предишна публикация (Capasso et al., 2005). Накратко, мишките бяха инжектирани интраперитонеално (i.p.) с празен разтвор (5% EtOH) или олеамид (Sigma-Aldrich, САЩ) (10 mg/kg, разтворени в 5% EtOH) 30 минути преди медикаментозно лечение. По време на лечението, мишките в контролната и лекуваната с олеамид група са получавали солена вода през устата, една група, лекуваща олеамид, са прилагани MZRW с ниска (10 g/kg) и висока доза (20 g/kg) чрез промивка. Броят на фекалните пелети се отчита на всеки 30 минути след приложението на олеамид в продължение на 2 часа.

Лечение с MZRW при нормални мишки

Мъжки мишки C57BL/6J с тегло 22-25 g са закупени от Laboratory Animal Services Center, Китайския университет в Хонг Конг. 23 мишки бяха разделени на две групи: MZRW (n = 12) и физиологичен разтвор (n = 11). Мишките получиха орално приложение съответно или на MZRW (10 g/kg), или на физиологичен разтвор. На всеки две мишки беше назначена клетка и кумулативният им брой фекални гранули се записва след 60 минути и 120 минути. Мишките се умъртвяват след експеримента, като серумите, илеума и дебелото черво се събират и веднага се съхраняват при -80 ° C.

Екстракция на РНК и количествен PCR анализ

Пробите на илеума и дебелото черво (30 mg) се претеглят и хомогенизират с TissueLyzer (Qiagen, Германия) и общата РНК се изолира и екстрахира по протокол TRIzol (Thermo Fisher Scientific, САЩ) (Lin et al., 2015). Бяха проведени анализи за оценка на експресията на целеви гени, използвайки 7900HT бърза PCR система в реално време (Applied Biosystems, Life Technologies, Калифорния, САЩ). Последователностите на праймера за FAAH бяха 5’-GTGGTGCTRACCCCCATGCTGG-3 ’(напред) и 5’-TCCACCTCCCGCATGAACCGCAGACA-3’ (обратно) (Capasso et al., 2005). експресията на иРНК се изчислява, използвайки метода на ΔΔ-CT анализ (Pfaffl, 2001), като нивата на β-актин се използват като вътрешна референция.

Етика на човека

Протоколът за изследване на хора е одобрен от Комитета по етика за използването на човешки субекти за обучение и изследвания, Хонконгски баптистки университет (одобрение № HASC/10-11/16) през септември 2011 г. Той е регистриран на ClinicalTrials.gov (NCT01695850) през септември 2012 г. и публикуван през 2013 г. (Zhong et al., 2013).

Етика на животните

Комитетът по етика на животните на Хонконгския баптистки университет одобри всички експериментални протоколи в съответствие с „Институционални насоки и наредби за животните“ от Министерството на здравеопазването, Специален административен район на Хонконг (HASC/16-17/0331).

Статистически анализ

Анализът на основните компоненти (PCA) и корелационният анализ бяха извършени с помощта на scikit-learn модул (Pedregosa et al., 2011). Корелационният анализ на Pearson е извършен между метаболитни промени и подобрение на CSBM в различните групи на лечение. Резултатите бяха класирани от Pearson r и стр стойности. Използват се сдвоени t-тест, еднопосочен ANOVA и χ2 тест за анализ на промяната на олеамида при количествен анализ. Промените на гените и протеините при мишки се сравняват, използвайки Student-t-тест. Всички статистически анализи бяха двустранни и нивото на значимост беше определено на 0,05. Количествени анализи на олеамид и тестове върху животни са направени в Prism 6 (GraphPad Software Inc., САЩ).

Резултати

Промяната на нивата на олеамид е отрицателно свързана с подобряване на CSBM при пациенти с FC, лекувани с MZRW

Фигура 1 Анализ на серумна фармакометаболомика на субекти от FC от триръко, рандомизирано, контролирано клинично проучване. (А) Дизайн на изследването за изследване на метаболитен биомаркер, свързан с ефикасността на лечението при пациенти с FC. Пациентите със сдвоени серумни проби бяха разделени в три групи въз основа на различни терапевтични подходи: плацебо група (n = 24), група Senna (n = 31) и група MZRW (n = 30). За всички пациенти серумни проби са взети преди и след лечението, съответно на 0 и 10 седмица. Междувременно броят на пълните спонтанни движения на червата на седмица (CSBM) за всеки пациент също се записва в една и съща точка от времето, както и на седмица 18. (Б) Блок-схема на фамакометаболомичния анализ за пациенти с FC, лекувани с различни терапии. Метаболитни характеристики, които са значително и специфично свързани с лечението с MZRW, бяха избрани след изчисления. (° С) Установено е, че една метаболитна характеристика (ID: 268) има отрицателна корелация (Pearson r = -0,59, стр = 0,00057) с промяна на CSBM (ΔCSBM) в групата MZRW, но не и в групата Senna или плацебо. (Д) Според съотношението маса: заряд (m/z) и маса, характеристика 268 е идентифицирана като олеамид.

маса 1 Статистика на пациенти с FC със сдвоени серумни проби преди и след лечението.

За изследване на систематичните промени след лечението е проведен фармакометаболомен анализ. Откриването на кои метаболити корелираха с подобрението на CSBM при пациенти с FC, лекувани с MZRW, но не и със Senna или плацебо, беше от особен интерес. За да се изследва това, бе направен нецелеви метаболомичен анализ за сдвоени серумни проби от 85 субекта. Общо в положителен режим бяха открити 2 073 фрагмента, докато в отрицателен режим бяха намерени 638. Според многовариантния статистически анализ не се наблюдава очевидна промяна на целия метаболитен профил между пробите преди лечението (изходно ниво) и пробите след лечението (Фигура S1).

Промяната на отделния фрагмент се изчислява като log2 пъти промяна (log2fc) между пробата от седмица 10 и пробата от седмица 0 от същата група пациенти (Фигура 1В). Междувременно се изчислява и подобрението на CSBM на тази група пациенти (CSBMwk10-CSBMwk0) (Фигура 1В). За всяка лечебна група беше извършен корелационният анализ на Пиърсън, за да се анализира връзката между промяната на метаболита и подобрението на CSBM за 2711 метаболитни фрагмента, открити както в положителен, така и в отрицателен режим (Фигура 1В). Метаболитите, чиято промяна значително корелира (дефинирани като стр 2+ наплив (Fonseca et al., 2013). По-специално се съобщава, че олеамидът причинява бавна чревна подвижност при мишки чрез активиране на CB1 рецепторите (Capasso et al., 2005).

Взети заедно, промяната на олеамид, известен регулатор на чревната подвижност, е значително и специфично корелирана с подобрение на CSBM (терапевтична ефикасност) на MZRW, което предполага, че сигналният път на олеамида може да бъде насочен от MZRW за облекчаване на FC.

Лечението с MZRW намалява нивата на серумен олеамид при пациенти с FC

За да потвърдим допълнително ролята на MZRW в регулирането на олеамида, ние анализирахме количествено нивата на серумен олеамид между пробите преди и след лечението на пациенти с FC. Интересното е, че в групата на плацебо нивото на олеамид е леко повишено [от 2.613 µg/mL (95% CI: 1.800, 3.425) до 3.195 µg/mL (95% CI: 2.305, 4.085)], но не е статистически значимо (стр = 0,227) след 8-седмично лечение (Фигура 2А). Групата Senna не забелязва промени в нивата на олеамид в продължение на 10 седмици (от 2.623 µg/mL (95% CI: 2.008, 3.239) до 2.536 µg/mL (95% CI, 1.999, 3.073), стр = 0.824) (Фигура 2А). Въпреки това, в групата на MZRW, серумните нива на олеамид са значително намалени (от 2.800 µg/mL (95% CI: 2.236, 3.364) до 1.854 µg/mL (95% CI: 1.408, 2.299), стр = 0,007) (Фигура 2А). Относителна промяна на процента на олеамид по време на периода на лечение също беше анализирана (плацебо, + 89,10% [95% ДИ: 1,30, 176,90); Сена, + 47,94% (95% CI: -6,75, 102.60); MZRW, -18,61% (95% CI: -41,99, 4,77)] (Фигура 2В). Последователно олеамидът беше регулиран надолу при 22 от 30 субекта в групата на MZRW; докато понижаването на регулирането на олеамида се наблюдава много по-малко при субекти от групите плацебо и сена (х 2 тест, стр = 0,0006, Фигура 2С). Взети заедно, този количествен анализ предполага, че лечението с MZRW причинява понижаване на циркулиращия олеамид при пациенти с FC.

Фигура 4 MZRW регулира надолу олеамид чрез повишаване на експресията на FAAH при нормални мишки. (А) Мишките бяха третирани с MZRW и физиологичен разтвор (контролна група). Номерът на фекалните пелети се записва на 15, 30, 60 и 120 минути. Във всеки момент от време броят на фекалните пелети в MZRW и контролната група за лечение се сравнява с t-тест на Student (*, стр 0,05; *, стр Ключови думи: MaZiRenWan, функционален запек, олеамид, фармакометаболомика, амидна хидролаза на мастни киселини

Позоваване: Huang T, Zhao L, Lin C-Y, Lu L, Ning Z-W, Hu D-D, Zhong LLD, Yang Z-J и Bian Z-X (2020) Китайска билкова медицина (MaZiRenWan) подобрява движението на червата при функционален запек чрез регулиране на надолу олеамид. Отпред. Pharmacol. 10: 1570. doi: 10.3389/fphar.2019.01570

Получено: 08 октомври 2019 г .; Приет: 04 декември 2019 г .;
Публикувано: 23 януари 2020 г.

Ruixin Zhu, университет Тонджи, Китай

Houkai Li, Шанхайски университет по традиционна китайска медицина, Китай
Luqing Zhao, столичен медицински университет, Китай

* Кореспонденция: Zhao-Xiang Bian, [email protected]

† Тези автори са допринесли еднакво за тази работа.