Джейн Абрахам

1 Отдел по хранителни науки, Университет на Илинойс, Урбана, Илинойс.

3 Програма за интегративна имунология и поведение, Университет на Илинойс, Урбана, Илинойс.

Родни У. Джонсън

1 Отдел по хранителни науки, Университет на Илинойс, Урбана, Илинойс.

2 Катедра по науки за животните, Университет на Илинойс, Урбана, Илинойс.

3 Програма за интегративна имунология и поведение, Университет на Илинойс, Урбана, Илинойс.

Резюме

Въведение

Ресвератролът, (3,5,4′-трихидрокси-транс-стилбене), е полифенол, открит главно в гроздето и червеното вино и има разнообразни биологични дейности, които осигуряват защита срещу оксидативен стрес, възпаления, сърдечно-съдови заболявания и рак. 13–19 Ресвератролът е от особен интерес за модулиране на заболявания с възпалителен компонент, тъй като няколко проучвания установяват, че той инхибира производството на реактивни кислородни видове (ROS) от неутрофили, моноцити и макрофаги 20–24, както и активиране на няколко транскрипционни фактора, включително ядрени фактор-кВ (NF-кВ) и активатор протеин-1 (АР-1). Наскоро редица проучвания върху животни се фокусираха върху невропротективните ефекти на ресвератрола, показвайки, че той забавя невропатологията, свързана с Алцхаймер 27 и болестта на Паркинсон 28 и предпазва от нараняване от мозъчна травма 29 и мозъчна исхемия. 30 Допълнително беше показано, че модулира холинергичната невротрансмисия и подобрява познанието при плъхове с диабет. 31

Това, че всички гореспоменати състояния са свързани с повишена експресия на IL-1β и други възпалителни цитокини в мозъка, представлява ясната възможност благоприятните ефекти на ресвератрола да се предоставят чрез неговите противовъзпалителни свойства. Въпреки броя на проучванията, които показват, че ресвератролът инхибира производството на възпалителни молекули чрез стимулирани микроглиални клетки in vitro, 32–35 не са провеждани проучвания при възрастни животни, изследващи възможността диетичният ресвератрол да намали IL-1β в мозъка по време на инфекция и да защити срещу дефицити в познанието.

Следователно, целта на настоящото проучване е да се определи дали хранителната добавка с ресвератрол ще инхибира експресията на IL-1β в хипокампуса, както и поведенчески и когнитивни дефицити при възрастни мишки, на които е даден LPS, за да имитира периферна инфекция. Резултатите предполагат, че свързаното с инфекцията невровъзпаление и когнитивните дефицити при пациенти в напреднала възраст могат да бъдат сведени до минимум чрез добавяне на ресвератрол.

Материали и методи

Животни и диета

Възрастни (3- до 6-месечни) и възрастни (от 22 до 24-месечни) мъжки мишки BALB/c от нашата специфична колония без патогени се поддържат, както е описано по-горе. 12 За да елиминираме ефекта на фитоестрогените, присъстващи в стандартната диета с гризачи за гризачи, използвахме диета без изофлавон (AIN93G), формулирана с казеин, а не със соя. Преди началото на всеки експеримент, на мишките беше осигурена стандартна диета за мишки AIN-93G (Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ) за 1-седмичен период на аклимация. По време на проучването на някои животни се предоставя AIN-93G, докато на други AIN-93G плюс 0,4% ресвератрол. Ресвератрол (кат. № 70675; партида № 125673; Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) беше хомогенно смесен в контролната диета AIN-93G, гранулиран и консервиран по начин, осигуряващ стабилността на ресвератрола. Всички процедури бяха одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Университета на Илинойс.

Поведенчески тестове

Локомоторна дейност

Активността на домашната клетка беше измерена с помощта на системата за проследяване на животни EthoVision (Noldus Information Technologies, Холандия) и общото преместено разстояние беше определено по време на 5-минутни тестове. Тестовете бяха проведени по време на тъмната фаза (между 0800 и 1700) на фотопериода при инфрачервено осветление, за да подпомогнат видеозаписа.

Пространствена работна памет

Версия на водния лабиринт на Морис е била използвана за определяне на зависими от хипокампала наклони и памет. Използваната апаратура за тестване е описана по-рано. 36 Обучението на животни се проведе по време на 5-дневна фаза на придобиване с три масирани опити, прилагани всеки ден. За да започнат всяко изпитване, мишките бяха поставени на платформата за 30 секунди преди началото на всяка сесия и след това псевдослучайно поставени във водата на едно от трите предварително определени места на 2 см от ръба на резервоара, обърнати към стената. На мишките беше позволено да плуват свободно в продължение на максимум 60 секунди или докато платформата не бъде разположена. След като мишката достигне платформата, беше необходимо да остане там за 30 секунди. Ако платформата не е била разположена през 60 секунди, мишките са били насочвани към платформата и им е било позволено да останат там за 30 секунди. След приключване на три последователни опита мишките бяха върнати в домашната си клетка. Параметрите на производителността, които бяха определени с помощта на системата за проследяване на животни EthoVision, включваха скорост на плуване, латентност към платформата и плуване от разстояние.

За да се оцени производителността на работната памет, мишките бяха тествани в същата парадигма за съвпадение на мястото, описана по-горе, с изключение на това, че платформата беше преместена в противоположния квадрант на пула; всички дистални визуални сигнали останаха постоянни. Животните бяха поставени на платформата за 30 секунди преди началото на теста за обръщане и им бяха дадени три опита за локализиране на платформата в новия целеви квадрант. Всички параметри на производителността останаха същите, както е описано по-горе.

Експериментален дизайн

Escherichia coli LPS (1.0 μg/мишка; серотип 0127: B8, Sigma, Сейнт Луис, МО) се разтваря в стерилен физиологичен разтвор непосредствено преди експеримент. Възрастни (n = 40) и възрастни (n = 48) мишки получиха стандартна диета AIN-93G или AIN-93G плюс 0,4% ресвератрол за 4 седмици. Приемът на храна и телесното тегло се измерват ежеседмично по време на проучването.

След 4 седмици хранителни добавки, локомоторната активност беше оценена в началото на тъмната фаза. Веднага след поведенческия тест мишките получиха 100-μL интраперитонеална (i.p.) инжекция със стерилен физиологичен разтвор или LPS (1.0 μg). След инжекциите, мишките бяха върнати в домашната си клетка и двигателната активност беше определена отново 2, 4, 8 и 24 часа по-късно. На 24 часа след инжектирането мишките бяха убити чрез задушаване на CO2 и бяха събрани кръв и хипокампална тъкан за определяне на нивата на IL-1β протеин и mRNA, съответно.

За да се определят ефектите на ресвератрола върху промените в обучението, зависещо от хипокампала, е проведено отделно проучване, при което е използвана обратна версия за обучение на водния лабиринт на Морис 4 и 24 часа след периферна имунна стимулация. По време на четвъртата седмица на хранителни добавки, животните се обучават във фаза на 5-дневно придобиване с три масирани проучвания, прилагани всеки ден. По време на фазата на придобиване платформата остана на постоянно място. На животните беше разрешен двудневен период на почивка и на 8-ми ден на мишките беше прилаган LPS и след това 4 и 24 часа по-късно бяха подложени на тест за обръщане, при който платформата беше преместена в противоположния квадрант на басейна, но всички дистални визуални сигнали останаха постоянни.

Определяне на експресията на протеин IL-1β и тРНК

Плазмени проби бяха анализирани за IL-1β протеин, като се използва комплект за имуноанализ на база топчета, комбиниран с комплект цитокинов реагент, както е описано от производителя (Bio-Rad, Hercules, СА). Мултиплексният анализ беше чувствителен към 37 Количествена PCR в реално време беше извършена, като се използва протоколът за експресия на гена Assay-on-Demand (Applied Biosystems, Foster City, CA), както е описано. 12 Накратко, cDNA се амплифицира чрез PCR, където целевата cDNA (Mm00434228_ml за IL-1β) и референтната cDNA (Mn99999915_gl за глюкоза-3 фосфат дехидрогеназа) се усилват едновременно с олигонуклеотидна сонда с 5'-флуоресцентен репортер -карбоксифлуоресцеин) и 3'-нефлуоресцентно гасително багрило. Флуоресценцията се определя на система за откриване на последователност ABI PRISM 7900HT (Perkin Elmer, Forest City, CA). Данните бяха анализирани с помощта на метода на сравнителния прагов цикъл (Ct) и резултатите бяха изразени като кратна разлика.

BV-2 микроглиална клетъчна култура

Обезсмъртената миша микроглия клетъчна линия, BV-2 (подарък от Linda Van Eldik, Northwestern University, Evanston, IL), се поддържа в 150-сантиметрови колби за тъканна култура (BD Falcon) в модифицирана от Dulbecco среда Eagle (DMEM), допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS) и 100 единици/ml пеницилин/стрептомицин при 37 ° C в овлажнен инкубатор под 5% CO2. Във всички експерименти клетките бяха ресуспендирани в DMEM, допълнен с 10% FBS и засяти в плаки с шест ямки (BD Falcon), преди да бъдат подложени на обработки. Клетъчната жизнеспособност се измерва чрез анализ на клетъчната пролиферация на тетразолиевото съединение MTS съгласно инструкциите на производителя (Promega, Madison, WI).

допълнена

Ефективност на възрастни и възрастни мишки по време на 5-дневна фаза на придобиване във водния лабиринт на Морис. Възрастни и възрастни мишки получиха контролна или добавена с ресвератрол диета в продължение на 4 седмици, а през четвъртата седмица на диетични добавки животните бяха обучени на 5-дневна фаза на придобиване. Разстояние плуване (A), латентност към платформата (Б.) и скорост на плуване (° С) са измерени както за възрастни, така и за възрастни мишки. Точките с данни представляват средната стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM) (n = 11-13). Средствата, отбелязани със звездичка (*) или цифров знак (#), се различават значително (p Фиг. 3A – C) след LPS. Анализът на дистанцията на плуване 4 часа след инжектиране на LPS разкрива значителни основни ефекти от диетата (F [1, 61] = 5.01, p = 0.02) и LPS (F [1, 61] = 12.70, p = 0.007). Анализът на латентността към платформата 4 часа след LPS разкри значителни основни ефекти на възрастта (F [1, 61] = 4,52, p = 0,03) и LPS (F [1, 61] = 6,70, p = 0,01) и тенденция към значимост на диетата (F [1, 61] = 2,82, p = 0,09), както и тенденция към значимост на възраст × диета (F [1, 61] = 3,67, p = 0,06) и възраст × LPS (F [ 1, 61] = 3,40, p = 0,06) взаимодействия. Post hoc сравненията показаха, че LPS нарушава обучението и паметта, както се оценява чрез дистанция на плуване (t [61] = 3,86, p = 0,006) и латентност към платформата (t [61] = 3,87, p = 0,007) 4 часа след LPS само при възрастни мишки. Забележително е, че това LPS-индуцирано инхибиране на работната памет при възрастните хора е напълно блокирано от хранителни добавки с ресвератрол, оценено чрез дистанция на плуване (t [61] = 3,57, p = 0,01) и латентност към платформата (t [61] = 3,72, p = 0,01).

Ресвератролът подобрява нарушената пространствена работна памет при възрастни мишки 4 часа след инжектиране на LPS. След 5 дни обучение за придобиване, мишките бяха оценени в тест за обръщане 4 h след инжектиране на липополизахарид (LPS). Разстояние до плуване до платформа (A), латентност за намиране на платформата (Б.) и скорост на плуване (° С) бяха оценени както за възрастни, така и за възрастни мишки. Стълбовете представляват средната стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM) (n = 11-13). Средствата с различни букви (a или b) са значително различни (p Фиг. 4A-C). Анализът на дистанция на плуване разкрива значим основен ефект от диетата (F [1, 65] = 3,17, p = 0,05), както и тенденция към значимост на диетата × LPS (F [1, 65] = 3,18, p = 0,06) взаимодействие. Анализът на латентността към платформата 24 часа след LPS разкрива значителни основни ефекти на възрастта (F [1, 63] = 3,94, p = 0,05) и LPS (F [1, 63] = 4,84, p = 0,03), както и тенденция към значимост на диета × LPS (F [1, 63] = 3,15, p = 0,08) взаимодействие за латентност към платформата. Post hoc сравненията показаха, че LPS-индуцираното увреждане на обучението продължава да съществува само при възрастни мишки, оценено по дистанция на плуване (t [65] = 3,43, p = 0,04) и латентност към платформата (t [63] = 3,39, p = 0,03). Както при 4-часовия момент при възрастни животни, на които е даден LPS, работната памет е напълно възстановена чрез хранителна добавка с ресвератрол, оценена по разстоянието на плуване (t [65] = 3,03, p = 0,06), както и латентността към платформата (t [ 63] = 2,23, р = 0,04). Тези данни показват, че способността за интегриране на новата позиция на платформата със съществуващите спомени за пространствените сигнали се нарушава от периферната имунна стимулация и се усложнява с възрастта. По-нататък те показаха, че диетата с добавка на ресвератрол осигурява значителна защита срещу тези намаления в ефективността.

В това проучване ние възприехме прагматичен подход, като доставихме ресвератрол като хранителна добавка. Подобно на други полифеноли, пероралната бионаличност на ресвератрол е ниска поради бързата екскреция и екстензивния метаболизъм в различни глюкуронидни и сулфатни конюгати. 45,46 Независимо от това, умерената консумация на червено вино, където ресвератролът е силно концентриран, е свързана с намален риск от сърдечно-съдови заболявания и рак. 47,48 Освен това, няколко доклада потвърждават, че орално прилаганият ресвератрол се абсорбира и преминава кръвно-мозъчната бариера и се включва в мозъка. 49–52 Противовъзпалителните ефекти на ресвератрола при възрастни мишки могат да бъдат свързани със способността му да инхибира фактори, участващи в генната транскрипция като митоген-активирана протеин киназа (MAPK), AP-1 и NF-κB. 25 Ресвератролът засяга NF-кВ чрез инхибиране на Iκ-В киназа, като по този начин предотвратява транслокацията на NF-кВ в ядрото. 25,53 Как се случва това не е ясно; може обаче ресвератролът да активира SIRT1, ензим от сиртуиновия клас на никотинамид аденин динуклеотид (NAD) + -зависими хистонови деацетилази, които деацетилират NF-κB, като по този начин инактивират транскрипционния фактор. 54,55

Наскоро Adler и сътр. 56 демонстрира, че инхибирането на NF-κB сигнализиране при стари мишки връща тъканните характеристики и глобалната генна експресия към тези на млади мишки. Този вид „подмладяване“ предполага, че непрекъснатото активиране на NF-κB сигнализирането може да насърчи процеса на стареене. Няколко проучвания показват, че SIRT1 е мощен инхибитор на NF-кВ транскрипцията. 32,54 Сигналната връзка между SIRT1 и NF-κB е особено интересна по отношение на стареенето, тъй като според редица проучвания SIRT1 действа за удължаване на продължителността на живота чрез инхибиране на NF-κB сигнализиране и това е достатъчно, за да обърне промените в генната експресия, свързани с възрастта при мишки. 54,56,57 Важно е да се отбележи, че ресвератролът не инхибира ефектите на LPS при млади възрастни. Това е важно, тъй като имунологичните и поведенчески отговори на инфекцията имат за цел да помогнат на домакина да се бори срещу инфекциозни агенти. Въпреки това, при третирани с LPS стари мишки, ресвератролът намалява IL-1β в периферията и мозъка и подобрява локомоторното поведение и зависимата от хипокампалната пространствена работна памет. Съответно, ресвератролът може да се окаже невропротективен срещу свързано с възрастта невро възпаление чрез понижаване на NF-κB сигнализирането и възстановяване на отговора на LPS до този на по-младите им кохорти.

Независимо от механизма, настоящите констатации показват, че хранителните добавки с ресвератрол могат да играят важна роля за обръщане на вредните ефекти на инфекцията върху поведението и познанието при пациенти в напреднала възраст. Тези открития могат също да подкрепят ролята на природните съединения като възможна превантивна и/или допълваща терапия за няколко невродегенеративни заболявания, причинени от невровъзпаление.

Благодарности

Това изследване беше подкрепено от безвъзмездни средства от Националните здравни институти (NIH) AG16710 и MH069148 (на R.W.J.). J.A. се подкрепя от награда на Националната служба за научни изследвания RT L. Kirschstein на института 5T32 DK59802 от Националния институт по диабет и храносмилателни и бъбречни болести (NIDDK) към Отдела за хранителни науки в Университета на Илинойс.

Изявление за разкриване на автор

Няма действителни или потенциални конкуриращи се интереси.