Резюме

  • IKK, инхибитор на кВ киназа
  • IL, интерлевкин
  • LPS, липополизахарид
  • PAI, инхибитор на плазминогенов активатор
  • TLR4, тол-подобен рецептор 4
  • TNF, фактор на туморна некроза

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Дванадесетседмични мъжки мишки C57bl6/J (Charles River, Брюксел, Белгия) и CD14 мутантни мъжки мишки, отглеждани на фона на C57bl6 (лаборатория Jackson, Bar Harbor, ME) бяха настанени в контролирана среда (обърнат 12-часов цикъл на дневна светлина, светлините се изключват в 10:00 ч.) със свободен достъп до храна и вода. Всички изброени по-долу експериментални процедури с животни са валидирани от местния етичен комитет на болницата в Рангейл и от Етичния комитет на Université catholique de Louvain Animal.

ендотоксемия

Мишките са хранени с контрола (A04, Villemoisson sur Orge, Франция) или диета с високо съдържание на мазнини, без въглехидрати в продължение на 2 или 4 седмици след протоколи. Диетата съдържа 72% мазнини (царевично масло и свинска мас), 28% протеини и -1 ден-1 в продължение на 4 седмици. За проучванията на скобите е поставен интрафеморален катетър, както е описано по-рано (18). Инсулиновата чувствителност се оценява от евгликемично-хиперинсулинемичната скоба, както е описано (19). Накратко, 6-часови гладни мишки бяха инфузирани с инсулин със скорост 18 (фармакологична, за оценка на инсулиновата чувствителност на цялото тяло) или 1 (физиологична, за оценка на ефекта на инсулина върху инхибирането на ендогенното производство на глюкоза) mU · kg -1 мин. -1 за 3 часа. За измерване на оборота на глюкоза, едновременно се влива d - (3Н) 3-глюкоза (Perkin Elmer, Бостън, Масачузетс) със скорост 30 μCi/kg, както е описано (17). d - (3H-3) -глюкозното обогатяване се определя от общата кръв след депротеинизация чрез утайка Zn (OH) 2, както е описано (19). За да се оцени дали CD14 мишките са чувствителни към LPS-индуцирано възпаление, на гладно мишки непрекъснато се влива LPS (0.5 mg · kg -1 h h -1) в продължение на 3 часа. Черният дроб и бялата мастна тъкан се събират и замразяват при -80 ° C.

Тестове за толерантност към глюкоза и LPS.

Извършени са интраперитонеални или орални тестове за поносимост към глюкоза, както следва: 6-часови гладни мишки се инжектират с глюкоза в перитонеалната кухина (1 g/kg глюкоза, 20% разтвор на глюкоза) или чрез сондаж (3 g/kg глюкоза, 66% глюкоза решение). Глюкозата в кръвта се определя с глюкомер (Roche Diagnostics) върху 3,5 μl кръв, събрана от върха на вената на опашката. 30 минути преди и 15 или 30 минути след натоварването с глюкоза се взема проба от 20 μl кръв за оценка на плазмената концентрация на инсулин. Извършен е LPS толерантен тест, както следва. Постените мишки се дават с LPS (300 μg/kg), разреден във вода или царевично масло (100 μl) или без LPS. Кръв се събира от върха на вената на опашката преди и 30 минути след сонда. Плазмата се отделя и замразява.

Микробно изброяване в чревното съдържание чрез флуоресцентна in situ хибридизация.

Съдържанието на цекалите, събрано след смъртта от мишки, се съхранява при -80 ° C. Пробите се размразяват върху лед и се разреждат 1:10 в стерилен ледено студен 0,1 mol/l PBS, рН 7,0. Суспензията се хомогенизира чрез пипетиране и се центрофугира при 3 500 g за 15 минути, за да се отстранят частиците. Супернатантът, съдържащ бактериалните клетки, се фиксира за една нощ в 4% (тегл./Об.) Параформалдехид. След това бактериалните клетки се измиват и ресуспендират два пъти в стерилен PBS и накрая се съхраняват в 50% етанол в PBS при -20 ° C до хибридизация с подходящи молекулни сонди, насочени към специфични региони на 16S рРНК. Използваните сонди бяха EREC 482, Bac303, MIB 661, Lab158, Bif164, SRB 687 и сонда D, специфична за групата Eubacterium rectale/Clostridium coccoides, видове Bacteroides, чревни бактерии на мишки, Lactobacilli/Enterococci, Bifidobacterium видове, сулфаторедуциращи бактерии и Enterobacteriaceae, съответно. Оцветяването с нуклеинова киселина DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) се използва за общ брой бактерии. ДНК сондите са маркирани с Cy3 флуоресцентна боя, така че хибридизираните проби могат да бъдат изследвани с помощта на флуоресцентна микроскопия, както е описано по-горе (20). Резултатите бяха изразени като log10 (бактериални клетки на грам цекално съдържание мокро тегло).

Количествена PCR в реално време.

Общите РНК от черен дроб, мускули и бяла мастна тъкан бяха приготвени с помощта на реагент TriPure (Roche, Базел, Швейцария), както е описано (21). PCRs бяха извършени с помощта на инструмент и софтуер на ABI PRISM 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA), както е описано (21). Последователностите на праймерите за целевите гени на мишки са достъпни при поискване (E-mail: patrice.caniuclouvain.be).

Уестърн петна.

Сто милиграма черен дроб се хомогенизират в лизисен буфер и протеините се разделят върху полиакриламиден гел и се прехвърлят в мембрана от поливинилидин флуорид, както е описано (17). Мембраните бяха инкубирани през нощта при 4 ° C с посоченото антитяло с ядрен фактор кВ-р65 (клетъчна сигнализация, Saint Quentin Yvelines, Франция) и инхибитор на кВ киназа β-P (Санта Круз, Le Perray en Yvelines, Франция). Свързването на специфичното първично антитяло се определя количествено, както е описано (17).

Морфометрия на мастната тъкан и оцветяване F4/80.

Чернодробна хистология.

Фракция от основния лоб на черния дроб беше фиксирана замразена в Tissue-tek в течен азотно-студен изопентан. За откриване на неутрални липиди замразените срезове се нарязват и се оцветяват с маслено червено О, като се използва 0,5% маслено червено О, разтворено в пропилей гликол за 10 минути при 60 ° С. След това нарязаните секции бяха оцветени.

Биохимични анализи.

Определянето на плазмения LPS в мишката се извършва с помощта на комплект, базиран на екстракт от Limulus amaebocyte (LAL комплект; Cambrex BioScience, Walkersville, MD). Пробите се разреждат от 1/40 до 1/80 и се загряват в продължение на 10 минути при 70 ° С. В оценката беше включен вътрешен контрол на изчисляването на възстановяването. Плазмените концентрации на инсулин се определят в 5 μl плазма, като се използва ензимно свързан имуносорбентен тест (Mercodia, Upssala, Швеция), следвайки инструкциите на производителя. Чернодробният триглицерид се определя, както следва: общите неутрални липиди се екстрахират от 30 до 50 mg черен дроб в CHCI3-MeOH (2: 1). Органичните екстракти бяха изсушени на въздух, разтворени в изопропанол и анализирани за триглицериди чрез измерване на глицерола, получен след ензимна хидролиза на триглицериди, с помощта на търговски комплект (Triglycerides GPO Trinder; Sigma, Lyon, France).