Li You

1 Училище за горски ресурси и опазване, Институт по храните и селскостопанските науки, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида, Съединени американски щати,

Дейвид Раберн Симънс

1 Училище за горски ресурси и опазване, Институт по храните и селскостопанските науки, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида, Съединени американски щати,

Крейг С. Бейтман

2 Катедра по ентомология и нематология, Институт по храните и селскостопанските науки, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида, Съединени американски щати,

Дилън П. Г. Шорт

3 Отдел за растителни и почвени науки, Университет на Западна Вирджиния, Моргантаун, Западна Вирджиния, Съединени американски щати,

Матю Т. Касон

3 Отдел за растителни и почвени науки, Университет на Западна Вирджиния, Моргантаун, Западна Вирджиния, Съединени американски щати,

Робърт Дж. Рабаглия

4 Защита на здравето на горите, Държавно и частно горско стопанство, Министерство на земеделието на САЩ, Горска служба, Вашингтон, Област Колумбия, Съединени американски щати,

Иржи Хълкр

1 Училище за горски ресурси и опазване, Институт по храните и селскостопанските науки, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида, Съединени американски щати,

2 Катедра по ентомология и нематология, Институт по храните и селскостопанските науки, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида, Съединени американски щати,

Замислил и проектирал експериментите: JH LY DRS CCB DPGS MTK RJR. Изпълнени експерименти: LY DRS CCB MTK DPGS. Анализира данните: LY DRS CCB MTK DPGS. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: JH MTK RJR. Написа хартията: DRS JH LY CCB DPGS MTK.

Свързани данни

Последователностите на MiSeq бяха депозирани в присъединяване на NCBI Sequence Read Archive SRP058537. Данните за последователността на Sanger бяха депозирани в присъединенията на GenBank KR119072 – KR119080 и KR871005 – KR871009.

Резюме

Въведение

Бръмбарите амброзия (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae и Platypodinae) са полифилетична колекция от клади в свръхразнообразните корояди. Бръмбарите амброзия са развили симбиотичния еволюционен режим, посочен като гъбарство или отглеждане на гъбички. Повече от 3200 известни вида бръмбари амброзия се хранят от гъбички, отглеждани върху обилни, но непокорни субстрати - мъртви дървета и части от дървета. Бръмбарите транспортират инокулум на специфични гъбични симбионти от техните натални галерии до новосъздадени галерии в орган за съхранение, наречен микангий [1]. Местоположението и морфологията на микангиите варират при различните видове и включват преорален, долночелюстен, елитрален, мезоторакален и много други [2] и в повечето случаи са филогенетично силно запазени [1,3]. Единствените потвърдени досега гъбични симбионти на бръмбари амброзия са аскомикотановите гъби (Ascomycota: Sordariomycetes), които се транспортират като пъпкуващи дрождоподобни псевдомицели или конидии [4]. Във всички проучени случаи гъбичките са екологично „ранни колонизатори“, специализирани в извличането на хранителни вещества от прясно мъртва дървесина, но липсващи значителни целулолитични способности [5] и повечето двойки амброзиални бръмбари-гъби колонизират наскоро убити (мъртви) дървета.

Бръмбарите амброзия стават все по-важни от икономическа и екологична гледна точка. Многобройни неместни видове са били неволно въведени в новите региони чрез международна търговия и в няколко такива случая по-рано безвредните видове бръмбари са се превърнали в инвазивни вредители [6–8]. В поне четири случая симбионтите от гъбички бръмбар амброзия са предизвикали остри и продължаващи епидемии сред податливи дървета гостоприемници [8–12].

Амброзиодмус (фиг. 1; [21–23]) е род от 80 вида в рамките на най-голямата група бръмбари амброзия, Xyleborini (1200 spp .; Coleoptera: Scolytinae). Родът заслужава по-внимателен контрол по няколко причини. Въпреки че икономическото му значение е минимално, той е разнообразен и разпространен в световен мащаб род. Много видове са екологично успешни и изобилни в целия си ареал. През двадесети век видовете все повече се установяват в неместните местообитания чрез интродукции, подпомогнати от човека. Само в САЩ първоначално азиатският A. rubricollis Eichhoff [24] присъства от близо пет десетилетия [25]. Съвсем наскоро A. minor Stebbing [26], вид, известен преди само от Южна Азия [22], се е разпространил в поне три югоизточни щати в САЩ [27,28].

симбиоза

Обърнете внимание на бялата гъбична мицелиална градина (стрелки) в галерията.

Докато по-голямата част от гъбите амброзия и бръмбарите амброзия зависят от новоизмрели и относително свежи дървесни тъкани, видът Ambrosiodmus изглежда е в състояние да колонизира дървесината по време на процеса на нейното разпадане, включително последните етапи, когато ксилемата се колонизира от конкурентни гъби от дърво гниене . Филогенетично, Ambrosiodmus е сестра на Ambrosiophilus, необичаен род бръмбари амброзия, много от които са загубили способността си да култивират собствените си гъбични градини и зависят от микоклепти или кражба на гъби [1]. Такива уникални екологични характеристики и филогенетично положение предполагат възможността за асоцииране с гъби, различни от тези, които обикновено се свързват с други бръмбари амброзия, но на практика нищо не се знае за симбионтите Ambrosiodmus. Единственият доклад за микангия и гъбични симбионти в Ambrosiodmus изследва A. rubricollis [24] и определя наличието на преорална микангя в основите на мандибулите зад лабрума [29]. Микангиалното съдържание е описано като глобозни конидии и къси хифални фрагменти, които дават „само бял вълнест мицел“, когато се отглеждат върху агар.

За да изясним присъствието и идентичността на гъбичните симбионти на Ambrosiodmus и да предположим екологичните навици и успеха на рода, ние характеризирахме гъбички, свързани с рода на бръмбарите амброзия и открихме напълно неочаквани симбионти. Фокусирахме се върху три различни вида Ambrosiodmus: A. lecontei Hopkins [23], A. minor и A. rubricollis, представляващи евразийската и американската фауна. Използвали сме изчерпателен набор от допълнителни подходи, включително количествено култивиране за характеризиране на основния симбионт, независимо от културата последователност на високопроизводителните общности за откриване на потенциално неизползваеми симбионти, анатомичен анализ на бръмбара за характеризиране на микангиите и тяхното съдържание, и морфологично кръстосано валидиране чрез микроскопия на идентичността на симбионта в микангиите и култивираните гъби.

Материали и методи

Изолиране и култивиране на гъбички от бръмбари гостоприемници и галерии

За да се изолират доминиращите гъбични симбионти в Ambrosiodmus, бяха взети проби от три вида бръмбари: A. lecontei (роден в Югоизточна САЩ), A. rubricollis (роден в Япония, но широко разпространен в САЩ) и A. minor (роден в Югоизточна Азия и наскоро установена в Югоизточна САЩ). Женски екземпляри и от трите вида са събрани чрез улавяне на светлина (август 2014 г. до април 2015 г.) и от умиращо до гнило дърво на Myrica cerifera (A. lecontei), Liquidambar styraciflua (A. rubricollis) и Platanus occidentalis (A. непълнолетен), в Гейнсвил, Флорида, САЩ (29 ° 37 ′ 16 ″ с.ш. 82 ° 22 ′ 32 ″ з.д.). Събирането се извършва в университетски имот и в частен имот на старши автор и не изисква разрешителни. Амброзиодмусът не е застрашен. Мъжките не са включени в нашите анализи, тъй като всички мъжки бръмбари Xyleborini ambrosia са нелетящи, редки и нямат микангии, необходими за транспортиране на симбиотични гъби [30]. Живите бръмбари и дървесни секции бяха транспортирани до лабораторията в чисти съдове с тъкан, навлажнена със стерилна вода. След идентифициране в лабораторията, цели бръмбари се измиват на повърхността чрез завихряне за 1 минута в 1 ml стерилна дестилирана вода с една малка капка (5′-CTTCCCTTTCAACAATTTCAC-3 ′), за да се получи

Микангиално присъствие и съдържание

Гъбична морфология върху агарова среда

За да документираме морфологията на гъбичните симбионти на Ambrosiodmus, използвахме шест изолата, които бяха възстановени от главите на трите вида Ambrosiodmus, както и два изолата, открити от галериите на A. minor и A. rubricollis (Таблица 1). Изолатите се култивират на PDA среда и се инкубират при 20 ° С в продължение на три седмици. Хифите бяха премахнати асептично от краищата на представителните гъбични колонии и бяха изследвани микроскопски с Nikon Eclipse 55i, оборудван с ProgRes® SpeedXT core 3 камера (Jenoptik Optical Systems).

маса 1

Субкултура Оригинална култура Гост или асоцииран бръмбар Източник на изолация Очакван CFU
68536853_white_myce Ambrosiodmus minor Екстракт от глава1500
68556855_white_myce А. непълнолетен Екстракт от глава1500
68606860_sub_white_myce A. lecontei Екстракт от глава4000
73247324_white_myce A. lecontei Екстракт от глава-
73467346_white_myce А. непълнолетен Галерия в Platanus occidentalis -
73537326_white_myce A. rubricollis Екстракт от глава30
73547341_white_myce A. rubricollis Екстракт от глава100
73737325_white_myce A. rubricollis Галерия в Liquidambar styraciflua -

Резултати

Изолиране и култивиране на гъбички от бръмбари гостоприемници и галерии

Индивидите от всеки от трите вида Ambrosiodmus съдържат един единствен гъбичен морфотип в най-малко две изолирани събития на екстракти от глава, а оценените CFU на един и същ доминиращ морфотип от различни събития на изолация варират от 10 до 4000 (Таблица 1). Субкултурите бяха криоархивирани в наклонени флакони с PDA, потопени в 15% глицерол и съхранявани при -80 ° C и депозирани в колекцията на Hulcr в Университета на Флорида и в колекцията от гъбични култури (CMW) в Института за горско стопанство и земеделска биотехнология (FABI) в Претория, провинция Гаутенг, Южна Африка.

Активни галерии Ambrosiodmus рутинно се намират в изгнили дървета. Дървесината в съседство с галерията Ambrosiodmus обикновено беше мека и гъста, а районът беше заобиколен от тъмни линии (фиг. 2). Тези линии са често срещан резултат от антагонистични взаимодействия между генетично различни гниещи гъби в колонизирана мъртва дървесина. Други изследвани до момента гъби амброзия не образуват такива защитни зони.

Филогенетични анализи

Флаводон срв. flavus изолати, с бръмбар гостоприемник в скоби, в рамките на флебиоидна клада на Polyporales. Стойностите в възлите показват ≥70% подкрепа за зареждане на ML, а удебелените клони показват ≥95% стойности на подкрепа на Байесова задна вероятност.

Анализ на ампликон на гъбична общност

Изследване на микангия

Серийните напречни сечения от главите на всички женски A. lecontei потвърждават наличието на една двойка преорални микангии в основата на мандибулите при девет от 11 изследвани бръмбари (Фигура 4А и 4В). Две останали глави на бръмбари не могат да бъдат визуализирани поради неоптимална ориентация по време на вграждането на парафин. Микангиалното съдържание е плътно натъпкана маса хифи с различен диаметър (фиг. 4С). Не са наблюдавани конидии или пъпки псевдомицел.

(А) Разрез, показващ цялата глава със сдвоени микангии зад мандибулите, с пунктирана линия, представляваща липсваща екзоскелетна структура. (Б) Уплътнени гъбични хифи, съставляващи микангиален инокулум. (В) Разхлабени хифи от микангиален пакет, с малки (стрелки) и по-големи (стрелки) хифи, вероятно представляващи съответно димитни генеративни и скелетни хифи. (D & E) Флаводон вж. flavus isolate 6860_sub_white_myce с димитни генеративни (D) и скелетни (E) хифи. Ключ: E, око; F, челен ръб (случайно повреден); м, микангиум.

Гъбична морфология

На PDA среда изолатите 6853_white_myce, 6855_white_myce и 6860_sub_white_myce произвеждат димитни хифи, очевидно с два диаметъра, но също с известни вариации в размера. По-малки, генеративни хифи (фиг. 4D) присъстваха в границите на колониите, но бързо бяха затъмнени от по-големи скелетни хифи (фиг. 4Е). Не са наблюдавани репродуктивни структури и скоби.

Дискусия

Всички анализи показват, че видовете Ambrosiodmus носят в своите микангии и култура в галериите си амбиозни базидиомикотанови симбионти, тясно свързани с Flavodon flavus (Basidiomycota: Polyporales). Състоянието на дърветата гостоприемници, в които са били събрани галериите на Ambrosiodmus, и структурата на дървото, заобикалящо галерията на бръмбарите, показват, че гъбичният симбионт е истински сапрофит, разграждащ дървесината (Фигура 2). Известни са много малко случаи, при които гъбичките превръщат разградената лигноцелулоза в пълноценна диета за своя животински симбионт. Следователно метаболитните аспекти на симбиозата на Амброзиодмус-Флаводон заслужават по-нататъшен контрол.

Ядрените 28S рДНК последователности на гъбични изолати, получени от A. minor, се различават от тези на гъби, култивирани от A. lecontei и A. rubricollis, чрез единична преходна мутация на пиримидин. Освен това, ITS rDNA последователностите от проби A. minor са идентични помежду си, но само на 94% са подобни на проби A. lecontei (таблица S1). Ambrosiodmus minor е представен наскоро в САЩ в сравнение с отдавна установената A. rubricollis и местната A. lecontei. Взети заедно, тези сравнения предполагат връзката на специфични гъбични щамове с утвърдените видове американски бръмбари и с най-новите видове имигрантски бръмбари.

Всички изолати са приблизително еднакво свързани със секвенции, получени от Flavodon flavus (Фигура 3). Като се има предвид 100% поддържаната монофилия и съответстващата хифална морфология, ние наричаме нашите изолати като Flavodon срв. flavus, докато по-нататъшните анализи подкрепят тяхната диференциация. Flavodon flavus е свободно живеещ дървесен сапрофит, описан от Северна Европа, място далеч извън разпространението на който и да е Ambrosiodmus [44]. Това може да означава, че гъбичните генетични маркери все още не са се отклонили от свободно живеещ роднина или че асоциацията е асиметрична, при която бръмбарите зависят от гъбата, но гъбата все още може да е способна на апосимбиотичен начин на живот. Повечето симбиози между насекоми и базидиомикотанови гъби са по същия начин асиметрични; това включва дървесните оси на Siricidae и короядните бръмбари, споменати по-горе, както и някои термити, отглеждащи гъби и някои мравки, отглеждащи гъби [49].

Ние съобщаваме за нова форма на режим на разпръскване на симбионт при гъбички амброзия: непъпкащ хифен растеж (Фиг. 4А и 4В). Изглежда, че A. lecontei mycangia е пълна с хифи с различен диаметър (фиг. 4С), потвърждаващи наличието на димитна базидиомикотанова гъба. Гъбата Flavodon flavus е описана като димитни и липсващи скоби [45] и това описание съответства на хифите, които наблюдаваме в mycangia (фиг. 4C) и от изолат 6860_sub_white_myce от A. lecontei (фиг. 4D и 4E), който молекулярно характеризираме като F. срв. flavus (Фигура 3).

Ambcrosiodmus lecontei mycangia почти сигурно са хомоложни на обичайните преорални mycangia при някои бръмбари Xyleborini ambrosia; по този начин изглежда, че необичайният начин на предаване на гъбички (хифи) е характеристика на новия гъбичен симбионт, а не на носителите на бръмбари. Обърнете внимание, че използваме термина „преорален“ за ксилеборин микангия, които традиционно се наричат ​​„долночелюстни“; терминът „долночелюстна” е зает от истинската долночелюстна микангия в Дендроктонус [2].

От анализа на MiSeq на ампликони и последователности на гъбични симбионти рДНК от култивирани изолати, ние твърдим, че Flavodon вж. flavus или комплекс от загадъчни видове, съставлява преобладаващото мнозинство от гъбичната общност. Следователно изглежда вероятно бръмбарът да използва гъбата като основен източник на храна в растението гостоприемник. Чрез асоциация със сапрофитна базидиомикотанова гъба може да се окаже, че родът на бръмбарите Ambrosiodmus е получил достъп до вездесъщ ресурс (мъртва и разлагаща се дървесина), недостъпен преди това за друга кора или бръмбар амброзия. Необходими са допълнителни проучвания, за да се потвърди тази хипотеза. Описаните по-горе подходи служат като модел за бързо и стабилно изследване и характеризиране на тази граница на симбиологията. Предвид броя на видовете бръмбари и гъби амброзия по света и нарастващия фокус върху изследванията върху тях, би трябвало да очакваме повече открития за такива взаимодействия и еволюционни иновации.