Статии

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Лицензиране
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Въведение

Медузите са включени във вида Cnidaria, древна група животни, които в морската среда са разработили няколко механизма, свързани с улавянето и защитата на плячката. Характерен тип книдарни клетъчни клетки е жилещият клетъчен нематоцит, намиращ се главно върху пипала и защитни органи. Нематоцитите съдържат нематоцистната органела, която от своя страна е съставена от капсула и вътрешна куха тубула в солен разтвор, съдържащ токсини, които се различават по състав между видовете медузи (Cheng et al. 2005; Ramasamy et al. 2005a, 2005b) . Нематоцистите могат да се разтоварят в отговор на различни механични и химични стимули, както и в отговор на случайни контакти и се считат за най-сложните смъртоносни оръжия в животинското царство (Tardent 1995).

активност

Cnidarian отровата е направена от сложна смес от биологично активни молекули, включително 5-хидрокситриптамин, хистамин, протеини като протеази и фосфолипази и малки пептиди. Токсините на нематоцистите проявяват много биоактивност като хемолитична, цитолитична, кластогенна, ензимна, кардиотоксична, невротоксична и инсектицидна активност (Mariottini et al. 2002; Li et al. 2005; Yu et al. 2005; Monroy-Estrada et al. 2007; Kang и др. 2009; Birsa и сътр. 2010). В много случаи цитолитичните, хемолитичните или невротоксичните ефекти са показани от няколко биологични анализа, сред които най-подходящ и най-използван е хемолитичният анализ, който е силно чувствителен и лесен за извършване (Marino et al. 2008). Поради технологични трудности с получаването и съхраняването на екстракти от отрова и тяхната лабилна природа, настоящото разбиране за cnidarianvenom е ограничено (Feng et al. 2010). Проведени са проучвания върху токсикологичните особености на книдариите, живеещи в Месинския проток (Marino et al. 2004a, 2004b, 2006, 2007). В Месинския проток медузите Pelagia noctiluca е в изобилие през цялата година, особено през пролетта и лятото, когато планктонната храна се предлага в по-голямо изобилие, което води до преходен вид на големи „цъфтежи“.

Pelagia noctiluca, cnidarian от клас Scyphozoa, Order Semaeostomeae, Family Pelagiidae, е малка пелагична розова медуза с фосфоресцираща камбана с диаметър 3–12 cm в диаметър и има нематоцисти, локализирани в пипалата, устните ръце и горната повърхност на камбаната. „Цъфтежът“ на тази медуза има отражение върху човешкото здраве и рецидиви върху икономическите дейности, включително туризъм и риболов. Нетоцистните токсини причиняват различни реакции при хората, вариращи от локални лезии, везикули и зачервяване до тежки и опасни усложнения като кардио- и невротоксични ефекти и синдром на Guillain-Barré (Burnett et al. 1986; Pang & Schwartz 1993; Tibbals 2006; Mariottini & Панел 2010).

Това проучване има за цел да изследва активността на суровата отрова, извлечена от изолирани нематоцисти на P. noctiluca върху рибните мембрани на червените кръвни клетки, чрез оценка на хемолитичната активност и лизозомната стабилност, и за изследване на протеиновия състав на тази отрова чрез HPLC разделяне и анализ на електрофореза, като се използват заешки еритроцити като най-добрите целеви клетки за свързания молекулярен биологичен анализ. Освен това, експерименти за инхибиране на хемолитичната активност на P. noctiluca с липидни компоненти на мембраните на еритроцитите.

Настоящото проучване може да представлява важен принос за разбирането на биологичните дейности на отровата на книдариан и за идентифициране на клетъчни цели за токсините и следователно може да доведе до откриването и прилагането на нови биоактивни съединения от природни източници.

Материали и методи

Изолация на нематоцисти

Образци от сцифозоя P. noctiluca бяха събрани по сицилианските брегове на Месинския проток. Нематоцисти са изолирани от маргинални пипала според Salleo et al. (1983). Накратко, оралните ръце се изрязват от всеки образец и се поставят в студена дестилирана вода (4 ° C), за да се позволи осмотичен лизис на нематоцитите и доставяне на органоидите. Получената суспензия многократно се филтрира с помощта на планктонни мрежи (40-, 60- и 100-μm око) и се центрофугира (хладилна центрофуга Eppendorf, 1700 ж за 5 минути), за да се изхвърлят отломките и да се намали обемът за извличане на отрова. Веднъж изолираните нематоцисти се съхраняват при –20 ° C, докато се използват.

Екстракция на отрова

Проби, съдържащи 90–100 нематоцисти/μL, бяха ресуспендирани в разтвор [145 mM натриев хлорид (NaCl), 10 mM фосфат, pH 7,4, осмотично налягане 300 mOsm/kg H2O], съвместим с физиологията на използваните еритроцити, и обработени с ултразвук върху лед с a Sonoplus (70 MHz, 20 s, 30 пъти) за извличане на капсулната течност. След това суровият екстракт се отделя от натрошени нематоцисти чрез центрофугиране (хладилна центрофуга Eppendorf, 1700 ж за 10 минути) и се отвеждат към биологичния анализ. Концентрацията на протеин в отровата се определя по метода на Bradford (1976), в сравнение със стандартите за концентрация на протеин от говежди серумен албумин (BSA).

Проби от рибна кръв

Взети са проби от рибна кръв от пет екземпляра от двете сладководни златни рибки Carassius auratus и морска вода златисто сив кефал Лиза аурата. Кръвни проби (1,5 ml) бяха взети от опашната вена в хепаринизирани флакони и незабавно анализирани за морфологично наблюдение, анализ на хемолиза и измерване на глутатион (GSH). За лизозомна стабилност се вземат кръвни проби (0,5 ml) с помощта на спринцовка, съдържаща 1 ml физиологичен физиологичен разтвор.

Морфологичен анализ

Морфологичен анализ на C. auratus и L. аурата еритроцити се извършва чрез намазване на хепаринизирана цяла кръв върху стъклен предмет. Кръвните проби от двата вида се инкубират с различни концентрации на суров екстракт в продължение на 90 минути. Слайдовете се изсушават на въздух за една нощ и след това се фиксират в абсолютен метанол за 20 минути преди оцветяване с 10% разтвор на Giemsa за 15 минути. Кръвни размазвания са наблюдавани от светлинния микроскоп Axio Imager Z1 (Zeiss) с обектив за потапяне с масленост 63 ×.

Анализ на хемолиза

Фосфолипиден инхибиторен ефект върху хемолитичната активност

Сфингомиелинът, фосфатидилсеринът и фосфатидилетаноламинът се разтварят в TBS, за да се получат концентрации от 25,0 и 250,0 μg/mL в реакционната смес. Тези инхибитори са относително неразтворими в TBS. За тези съединения изходните разтвори се обработват с ултразвук (Branson, Model B15, Danbury, CT) при 4 ° C за 20 s и се центрофугират при 27000 ж за 30 минути (Tong & Kuksis 1986).

Инхибиторите, използвани при различни концентрации, се смесват със суспензиите на еритроцитите и след 20 минути преинкубация се добавят към отровата за цитотоксичните анализи. Контролната лиза се измерва, както е описано по-горе.

Лизозомна стабилност на червените кръвни клетки на рибите

Лизозомната стабилност на рибените червени кръвни клетки се оценява, като се използва анализ на неутрално задържане на червено (NRR), както е описано от Lowe et al. (1995), с някои модификации. За двете C. auratus и L. аурата, бяха приготвени шест туби, съдържащи 200 μL от смес кръв/физиологичен разтвор, и след това беше добавена суровата отрова при концентрации съответно от 0,4, 4, 8, 20, 28 и 40 μg/ml. Смесите се инкубират в продължение на 30 минути и след това 40 μL от всяка проба се пипетират в центъра на предметното стъкло на микроскопа и се инкубират в продължение на 15 минути в светлоустойчива камера за влажност при 4 ° C, за да се прилепят клетките. След това излишният разтвор се оттича внимателно и към клетъчния слой се добавят 40 μL работен разтвор на неутрално червено багрило (10 μL в 2 ml физиологичен разтвор от изходен разтвор от 20 mg NR в 1 ml диметил сулфоксид). След 15 минути инкубация отгоре се поставя покриващо стъкло и предметите се изследват с помощта на светлинна микроскопия (40 ×). Задържането на багрилото в лизозомите в клетките се записва на всеки 15 минути през първия час, а след това на интервали от 30 минути, докато над 50% от клетките демонстрират изтичане на неутралното червено багрило от лизозомите, за общ период от 180 мин.

Измерване на глутатион (GSH) в еритроцити, изложени на сурова отрова

GSH беше измерен по метода на Beutler (1975) с лека модификация. Към 0,1 ml рибена цяла кръв се добавя сурова отрова (90–100 нематоцисти/μL) при концентрация от 0,4, 4, 8, 20, 28 и 40 μg/ml. Смес от 0,2 ml се утаява с 30% трихлороцетна киселина (TCA) (1: 3 v/v, кръв: киселина) и се центрофугира при 4500 ж в продължение на 5 минути и 0,5 ml от тази супернатанта се добавя към 2,0 ml от 0,3 М разтвор на Na2HPO4 (двунатриев фосфат) и 0,25 ml DTNB (5,5-дитиобис-2-нитробензоена киселина) се добавя към този разтвор. Намаленият GSH се измерва като разлика в стойностите на абсорбция на пробите в присъствието и отсъствието на DTNB при 412 nm. Стойността на GSH се изчислява като μmol GSH/g хемоглобин.

Концентрацията на хемоглобина (Hb) се определя в кръвна проба със същите концентрации на суровата отрова, използвана за измерване на GSH, въз основа на образуването на цианометахемоглобин, използвайки разтвор на Драбкин (Van Kampen & Zijlstra 1961), със спектрофотометрична абсорбция при 540 nm.

Натриев додецил сулфат полиакриламиден гел електрофореза (SDS-PAGE)

Анализът на електрофорезата се извършва в двойно-плоча клетка Mini-Protean II (Bio Rad). Приготвянето на гелове, проби и електрофореза се извършва в съответствие с условията, описани от Laemmli (1970). Пробите се денатурират чрез кипене в зареждащ буфер [25 mM 2-амино-2-хидроксиметил-пропан-1,3-диол (TRIS основа) 192 mM глицин, 1% w/v натриев додецил сулфат (SDS), рН 8.3], съдържащ β-меркаптоетанол, преди да бъдат поставени върху гела. Протеините се оцветяват (Brilliant Blue R G250 0,1%, 40% метанол, оцетна киселина 1%) и се обезцветяват с оцетна киселина 0,1%, 0,4% метанол, дестилирана вода. Геловете са калибрирани със стандартно протеиново молекулно тегло (Sigma-Aldrich).

HPLC хроматография за изключване на размера

P. noctiluca екстрактът от нематоцисти беше подложен на хроматография за изключване на размера, използвайки BioSuite 250, 10 μm SEC, 7.5 × 300 mm колона (Waters) върху HPLC система с течна хроматография (Shimadzu Scientific Instruments, SSI, Северна Америка). Колоната се измива с TBS (NaCl 150 mM, TRIS HCI 10 mM, рН 7.4).

Използва се инжекционен обем от 200 μL при скорост на потока от 1 mL/min за 30 минути. Хроматограмата се записва с двоен UV детектор при 280 nm и 220 nm (mAU) в TBS.

Елуатът, съответстващ на всеки пик, се събира във фракции от 1 mL/min. Събраните фракции се концентрират чрез центрофугиране при 500 ° С ж с микроконцентратори (3K Omega Centrifugal Devices Nanosep), а крайните концентрирани проби се съхраняват при –80 ° C до употреба.

Статистически анализ

Резултатите са изразени като средно ± стандартно отклонение. Данните бяха анализирани чрез дисперсионен анализ (ANOVA) и считани за статистически значими при стр Хемолитична активност и характеризиране на отровата на нематоцисти от Pelagia noctiluca (Cnidaria: Scyphozoa)