Роли Концептуализация, разследване, методология, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

хексафосфат

Свързана лаборатория за изследване на бъбречна литиаза, Университетски институт за изследвания на здравните науки (IUNICS-IdISBa), Университет на Балеарските острови, Ctra Valldemossa, Палма де Майорка, Испания

Роли Концептуализация, разследване, методология, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Свързана лаборатория за изследване на бъбречна литиаза, Университетски институт за изследвания на здравните науки (IUNICS-IdISBa), Университет на Балеарските острови, Ctra Valldemossa, Палма де Майорка, Испания

Разследване на ролите, методология

Свързана лаборатория за изследване на бъбречната литиаза, Университетски институт за изследвания на здравните науки (IUNICS-IdISBa), Университет на Балеарските острови, Ctra Valldemossa, Палма де Майорка, Испания

Разследване на ролите, методология

Affiliation Serveis Cientistotècnics, Университет на Балеарските острови, Ctra Valldemossa, Палма де Майорка, Испания

Разследване на ролите, методология

Affiliation Serveis Cientistotècnics, Университет на Балеарските острови, Ctra Valldemossa, Палма де Майорка, Испания

Разследване на ролите, методология

Affiliation Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental i Ciències de la Salut, University Institute of Health Sciences Research (IUNICS-IdISBa), University of Balearic Islands, Ctra Valldemossa, Palma de Mallorca, Spain

  • Е. Треви,
  • А. Коста-Бауза,
  • Ф. Берга,
  • Р. М. Гомила,
  • Г. Марторел,
  • М. Р. Мартинес-Синьони

Фигури

Резюме

Обективен

За оценка на нивата на урината на инозитол фосфати (InsPs) при плъхове, които са получавали различни соли на мио-инозитол хексафосфат (InsP6) чрез сондаж или чрез перорално приложение.

Методи

Тридесет плъха са получавали диета AIN-76A (при която InsPs не се откриват) в продължение на 15 дни. След това 12 плъхове получиха InsP6 чрез сонда като Na сол или Ca/Mg сол; след 4 дни Na ​​или Ca/Mg InsP6 се прилага с вода, съдържаща 15 g/L захароза и се събират проби от урина. Останалите 18 плъхове получават орален InsP6, в който 0,5 g захар се комбинират с InsP6 като Na сол, Ca/Mg сол или Na сол с CaCO3; ежедневно се събират проби от урина. Нивата на InsPs в урината бяха определени с помощта на неспецифичен метод и специфичен метод (електрофореза в полиакриламиден гел, PAGE) и различни InsPs бяха идентифицирани чрез масспектроскопия (MS).

Резултати

След 15 дни диета без InsP6, неспецифичният метод не открива никакви уринарни InsPs, а МС открива само InsP2. След прилагане на Na-InsP6 чрез сондаж, неспецифичният метод посочва повече InsPs в урината, отколкото количеството InsP6, определено от PAGE. МС посочи наличието на пикочни InsP2, InsP3, InsP4, InsP5 и InsP6 при тези плъхове, със забележими вариации сред животните. Използването на същото лечение за администриране на Ca/Mg-InsP6 доведе до по-ниско общо съдържание на InsPs в урината и по-ниско ниво на InsP6. Пероралното приложение на InsP6 като захарно хапче доведе до по-ниски нива на InsPs в урината, отколкото прилагането на InsP6 чрез сондаж, а приложението като хапче Ca/Mg или хапче Ca/Mg с CaCO3 доведе до по-ниски нива от приема на хапче Na.

Заключение

Прилагането на InsP6 на плъхове води до отделяне на смес от различни InsPs. Плъховете по-ефективно абсорбират InsP6, когато се доставят без диетични компоненти, които пречат на поглъщането му, като йон Ca и захар.

Цитат: Grases F, Costa-Bauzá A, Berga F, Gomila RM, Martorell G, Martínez-Cignoni MR (2019) Прием на мио-инозитол хексафосфат и отделяне с урина на инозитол фосфати при плъхове Wistar: Gavage срещу перорално приложение със захар. PLoS ONE 14 (10): e0223959. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223959

Редактор: Хуан Дж. Лоор, Университет на Илинойс, САЩ

Получено: 19 март 2019 г .; Прието: 2 октомври 2019 г .; Публикувано: 18 октомври 2019 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни се намират в ръкописа и в неговите поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Авторът (ите) не е получил конкретно финансиране за това произведение.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Някои компоненти на средиземноморската диета, като ядки, бобови растения и пълнозърнести храни, съдържат изобилие от мио-инозитол хексафосфат (InsP6) и по този начин някои от положителните ефекти на тази диета се приписват на това съединение [1]. Метаболитната трансформация на InsP6 трябва да се характеризира, за да се разберат по-добре неговите полезни ефекти, но малко изследвания са изследвали тази тема. Последни проучвания показват, че след като InsP6 се появява в телесните течности, няколко фосфатази го метаболизират в множество фосфорилирани форми, от InsP5 до InsP2 [2]. В допълнение, InsP6 също се образува в клетките чрез de novo синтез [3].

Изследванията на InsP6 и неговия метаболизъм също са сложни поради аналитичната сложност на идентификацията и количественото определяне на различните видове и изомери. Една от причините за това е, че лошите спектрални характеристики на тези молекули затрудняват идентифицирането им чрез традиционни спектрофотометрични или флуорометрични методи [1]. Втората причина е, че те присъстват в много ниски концентрации в среда, която съдържа изобилие от фосфатни йони, и те лесно се адсорбират върху различни материали (като стомана [4], [5]), така че по време на изолацията възстановяването може да бъде лошо или те могат да бъдат трансформирани в различни форми [6]. Съчетаването на високоефективна течна хроматография (HPLC) с масспектрометрия (MS) подобри откриването на тези съединения [7]. HPLC, свързана с тандемна мас спектрометрия (MS/MS) доведе до допълнителни подобрения в измерването на инозитол фосфати (InsPs) в биологични проби [8], [9].

Поради аналитичните трудности при измерването на InsPs, има ограничени познания за влиянието на InsP6 с храната, абсорбцията и метаболизма на InsP6 и отделянето на InsPs с урината. В тази статия изследвахме абсорбцията, метаболизма и екскрецията на InsP6 при женски плъхове Wistar.

Материали и методи

Животни, диети и експериментален дизайн

Женски плъхове Wistar, закупени от Envigo (Барселона, Испания), бяха използвани за оценка на отделянето на InsPs с урината след перорално приложение на различни формулировки на InsP6. Животните бяха настанени в отделни клетки в контролирана от температурата стая (23 +/- 1 ° C) с 12-часов цикъл светлина-тъмнина и получиха диета AIN-76A (Harlan, Indianapolis, IN, USA), синтетична пречистена храна, която има неоткриваеми нива на InsP6 и други InsPs. Експерименталните интервенции започнаха 15 дни след като плъховете започнаха да консумират тази диета.

Администриране на InsP6 чрез сондаж

Дванадесет женски плъхове бяха претеглени и разделени на две групи (6 животни на група), така че средното тегло на плъхове във всяка група беше сходно (260 g). Групата за измерване на Na-InsP6 получава сонда от 0,03 mmol InsP6Na12 (27,7 mg/1,3 ml) всяка сутрин (група A), а групата за измерване на Ca/Mg-InsP6 получава измерване от 0,03 mmol InsP6Mg2Ca4 (25,71 mg/1,3 ml) всяка сутрин (Група Б). След ден 4 (4 приема), сондата спря и InsP6 се прилага от бутилка с 15 ml вода, съдържаща 0,03 mmol Na-InsP6 или Ca/Mg-InsP6 и 15 g/L захароза за 3 и 10 дни. На 7-мия ден (4-дневен сондаж + 3 дни течност) и 14-ия ден (4 дни сондаж + 10 дни течност) се събира 24 часа урина с помощта на отделни метаболитни клетки. Плъховете консумирали чешмяна вода с 5 g/L захароза през тези 24-часови периоди.

Перорално приложение на InsP6 като захарна пелета

Осемнадесет животни бяха разделени на три групи (6 животни на група), така че средното тегло на плъхове във всяка група беше 240 g. Всяка сутрин групата хапчета Na-InsP6 получава 0,03 mmol InsP6Na12, смесен с 0,5 g фондан (полутвърда захарна смес, като носител) (Група C) [10], [11], групата Ca/Mg-InsP6 хапчета получава 0,03 mmol InsP6Mg2Ca4, смесен с 0,5 g фондан (група D), а групата хапчета Na-InsP6-Ca получава 0,03 mmol InsP6Na12 + 0,36 mmol CaCO3, смесен с 0,5 g фондан (група E). След това се събират проби от урина в продължение на 24 часа на 0, 7, 14, 21, 28 и 35 дни, като се използват отделни метаболитни клетки.

Всички процедури са извършени съгласно директива 86/609/ЕИО, по отношение на защитата на животните, използвани за експериментални и други научни цели. Официално разрешение за извършване на опити с животни е предоставено от Comité de Ética de Experimentación Animal (CEEA) на Университета на Балеарските острови (Exp. 2016/19/AEXP).

Неспецифично спектрометрично количествено определяне на InsPs

Глобалното количествено определяне на InsPs беше извършено по непряк колориметричен метод, като се използва алуминиево-ксиленол оранжев [12].

Извличане на InsPs с TiO2

Екстракцията на InsPs се извършва, както е описано по-рано [2, 13], като се използва TiO2 (Titansphere TiO2 5 μm; GL Sciences).

Идентифициране на InsPs от държавите-членки

След екстракция на InsPs с TiO2 се отделят общо 150 μL от възстановения елуат и 10 μL се инжектират в масов спектрометър с висока разделителна способност Q Exactive Orbitrap, който има сонда с нагрята йонизация с електроспрей (HESI) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, САЩ), която работеше в режим на отрицателна йонизация. Пример за мас спектър е даден на фиг. 1.

Плъх # 6 (Група А) след 14 дни приложение на IP6Na12.

Идентифициране и полуколичествено определяне на InsP6 чрез PAGE

След екстракция на InsPs с TiO2, обем от 850 μL от разтворения елуат се изпарява, докато обемът стане 30 μL, за използване в полиакриламидна гел електрофореза (PAGE), следвайки описана по-рано процедура [14].

Статистика

Данните са представени като средни стойности ± стандартна грешка (SE). Вътрешногрупово сравнение на концентрацията в урината и екскрецията на InsPs (в различни дни) бяха извършени с помощта на еднопосочни повтарящи се мерки ANOVA и Bonferroni като post hoc тест за всяка група. Междугруповите сравнения на концентрацията на урина и екскрецията на InsPs в дни 0, 7, 14, 21, 28 и 35 бяха оценени с помощта на двупосочни повтарящи се мерки ANOVA, за да се оцени ефектът от лечението, периодите и взаимодействието х период. Двустранна р-стойност по-малка от 0,05 се счита за статистически значима. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на SPSS версия 23.0 (SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ).

Резултати

Администриране на InsP6 чрез сондаж

В съгласие с предишни експерименти [2], когато плъховете получават диета без InsP6 в продължение на няколко седмици, неспецифичен метод не открива InsPs, но MS откри InsP2. Прилагайки Na-InsP6 чрез сонда плюс 3/10 дни с вода, съдържаща Na-InsP6 и захароза, наблюдавахме присъствието на InsP6 в урината в променливи количества (Фигура 2). Както се очакваше, общият InsPs, определен по неспецифичния метод, беше по-голям от количеството InsP6, определено от PAGE (Таблици 1–3). Данните за MS показват голямо увеличение на InsP2 в урината и наличието на InsP3, InsP4, InsP5 и InsP6 (Фигура 3). Имаше и забележими вариации между животните.

SB (буфер за проби), S1 (стандарт 1: 1,25 nmols InsP6), S2 (стандарт 2: 5 nmols InsP6), проби от урина (плъхове 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A).

Средно ± SE от стойностите, получени от всеки плъх.

По време на събирането на ден плъховете пиеха чешмяна вода с 5g/L захароза, за да увеличат диурезата. Група А - администриране на IP6Na12, Група Б - администриране на InsP6Mg2 Ca4. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SE. Сравнението между групите беше проведено чрез независими проби t-тест.

Група A - приложение на IP6Na12 чрез сондаж Група B - приложение на InsP6Mg2 Ca4. чрез сондаж Група C - перорално приложение на IP6Na12, Група D - перорално приложение на IP6Mg2Ca4, Група E - перорално приложение на IP6Na12 + Ca. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SE.

Група A - приложение на IP6Na12 чрез сондаж Група B - приложение на InsP6Mg2 Ca4. чрез сондаж Група C - перорално приложение на IP6Na12, Група D - перорално приложение на IP6Mg2Ca4, Група E - перорално приложение на IP6Na12 + Ca. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SE.

Когато същата процедура беше извършена с помощта на Ca/Mg-InsP6, нивата в урината на общите InsPs и специфичните InsP6 (определени от PAGE) бяха по-ниски (Таблици 1–3). Данните от MS показват наличието на InsP2, InsP3, InsP4, InsP5 и InsP6, но в по-малки количества, отколкото при плъхове, дадени Na-InsP6 (Фигура 4).

Средно ± SE от стойностите, получени от всеки плъх.

Прилагане на InsP6 като захарно хапче

Когато Na-InsP6 се прилага като захарно хапче (а не като сондаж) за същия период от време, има по-ниски количества уринарни InsPs (таблици 2 и 3). В допълнение, количествата бяха дори по-ниски, когато InsP6 се прилагаше като Ca/Mg-InsP6 или като Na-InsP6-Ca, а не като Na сол (таблици 2 и 3). Интересното е, че сумите на InsPs постепенно се увеличават през 35-те дни на проследяване (таблици 2 и 3). Резултатите от MS показват наличие на InsP6 в много променливи количества (Фигура 5).

Стойности на InsP5 и InsP6, получени от всеки плъх от групата (I) и средните стойности ± SE на InsP1-InsP6 (II).

Дискусия

Предишно проучване съобщава, че когато плъхове са консумирали диета без InsP6 за дълъг период, в урината им се открива само InsP2 [2], както се наблюдава в настоящото проучване. Представените тук резултати показват, че отделянето на InsPs е много по-голямо, когато InsP6 се прилага самостоятелно (чрез сондаж) като Na-InsP6, отколкото като Ca/Mg-InsP6, както може да се види в таблици 2 и 3. Прилагането след InsP6 в питейната вода със захароза не увеличава количеството на InsPs в урината. Специфичното определяне на InsP6 чрез PAGE и MS открива InsP6 в проби от урина на 14 дни при плъхове, които са получили Na-InsP6 чрез сонда. Прилагането на Ca/Mg-InsP6 чрез сондаж води до по-ниски нива на InsP6, InsP5, InsP4 и InsP3 в урината, отколкото прилагането на Na-InsP6 чрез сондаж.

Прилагането на InsP6 като хапче с 0,5 g фондан, а не чрез сондаж, доведе до много по-ниски количества InsPs в урината. Въпреки това, InsPs се увеличават много постепенно в продължение на 35 дни при плъхове, получавани InsP6 като захарно хапче. Количествата на InsP6 в урината са по-ниски при плъхове, на които InsP6 е дадено като захарно хапче, отколкото чрез сондаж.

Както и в предишни проучвания [12], по време на приложението на InsP6 първоначално наблюдаваме значително повишаване на нивото на InsP в урината и това е последвано от намаляване. Това вероятно се дължи на индуцирането на метаболитни ензими с течение на времето. Обикновено отделянето на урина с големи количества от общата InsPs придружава повишена екскреция на InsP6, въпреки че тази корелация не винаги възниква. Също така забелязахме, че когато нивата на урина в общия InsP са ниски, InsP6 в урината се открива само при някои от животните, въпреки че другите InsPs присъстват във всички животни. Това може да се дължи на действителни биологични вариации между животните (вероятно в резултат на различни нива на фитаза и алкална фосфатаза) или резултат от аналитичен проблем, причинен от сложността на измерването на InsP6 в биологични проби. Поради това е необходимо да се има предвид, че някои от ползите от потреблението на InsP6 не се дължат изключително на InsP6 и че други InsP също могат да осигурят важни ефекти. Например InsP6 и/или смесите от неговите продукти на хидролиза могат да действат като мощни инхибитори на кристализацията и да предотвратят развитието на патологични калцификати [15, 16].

Настоящото проучване също така показва, че присъствието на захар или калциев йон изглежда пречи на абсорбцията на InsP6, като по този начин води до намалена екскреция. Всъщност калциевият йон образува неразтворима сол на InsP6, а захарта образува неразтворими адукти, които предотвратяват абсорбцията. По този начин InsP6 е подобен на бисфосфонатите, тъй като максималната абсорбция се получава с натриева или калиева сол и на гладно, а други хранителни вещества възпрепятстват усвояването му.

Ограничение на настоящото проучване е, че ние прилагахме сонда за InsP6 за кратък период. Това беше неизбежно, тъй като многократният сондаж в продължение на много дни стресира животните. Друго ограничение е, че нашето идентифициране на различните InsPs от страна на държавите-членки трябва да се счита за условно. Въпреки че нашата идентификация на InsP6 е сигурна, ние не можем да бъдем сигурни за неговото количествено определяне, нито за количественото определяне на други InsPs, тъй като по време на процеса на откриване може да са настъпили процеси на счупване на тези съединения.

Заключение

Диетичната консумация на InsP6 води до отделяне на смес от InsPs, от InsP2 до InsP6. Нивото на отделените InsPs в урината корелира с количеството InsP6, което присъства. Абсорбцията на InsP6 е по-голяма, когато се доставя при липса на други хранителни компоненти, като калциев йон или захар, които пречат на усвояването.

Подкрепяща информация

S1 Таблица. Резултати от концентрация и екскреция, определени чрез неспецифично спектрометрично количествено определяне на InsPs.

По време на събирането на ден плъховете пиеха чешмяна вода с 5g/L захароза, за да увеличат диурезата. Група A - приложение на IP6Na12, Група B - приложение на фитин.

Таблица S2. Стойности на концентрацията и екскрецията на InsP6, получени чрез полуквантифициране с електрофореза в полиакриламиден гел (PAGE).

По време на събирането на ден плъховете пиеха чешмяна вода с 5g/L захароза, за да увеличат диурезата. Група A - приложение на IP6Na12, Група B - приложение на фитин.

S3 Таблица. Резултати от концентрацията, получени чрез неспецифично спектрометрично количествено определяне на InsPs.

По време на събирателния ден плъховете пиеха чешмяна вода с 10 g/L захароза, за да увеличат диурезата. GC - администриране на IP6Na12, GD - администриране на IP6Mg2Ca4, GE – IP6Na12 + Ca.

Таблица S4. Стойности на екскреция, получени чрез неспецифично спектрометрично количествено определяне на InsPs.

По време на събирателния ден плъховете пиеха чешмяна вода с 10g/L захароза, за да увеличат диурезата. GC - администриране на IP6Na12, GD - администриране на IP6Mg2Ca4, GE – IP6Na12 + Ca.