Резюме

ОБЕКТИВЕН-Диабетът и затлъстяването се характеризират с нискостепенно възпаление, чийто молекулярен произход е неизвестен. По-рано установихме, първо, че метаболитната ендотоксемия контролира възпалителния тонус, наддаването на телесно тегло и диабета, и второ, че храненето с високо съдържание на мазнини модулира чревната микробиота и плазмената концентрация на липополизахарид (LPS), т.е. метаболитната ендотоксемия. Следователно остава да се демонстрира дали промените в чревната микробиота контролират появата на метаболитни заболявания.

чревната

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯ -Променихме чревната микробиота посредством антибиотично лечение, за да покажем, първо, че промените в чревната микробиота могат да бъдат отговорни за контрола на метаболитната ендотоксемия, нискостепенното възпаление, затлъстяването и диабет тип 2 и, второ, да осигурим някои отговорни механизми за такъв ефект.

РЕЗУЛТАТИ—Установихме, че промените в чревната микробиота, индуцирани от антибиотично лечение, намаляват метаболитната ендотоксемия и цекалното съдържание на LPS както при мишки с високо съдържание на мазнини, така и при ob/ob. Този ефект е корелиран с намалена глюкозна непоносимост, наддаване на телесно тегло, развитие на мастна маса, по-ниско възпаление, оксидативен стрес и експресия на иРНК маркер на инфилтрация на макрофаги във висцерална мастна тъкан. Важното е, че храненето с високо съдържание на мазнини силно повишава чревната пропускливост и намалява експресията на гени, кодиращи протеини в стегнатите връзки. Освен това, липсата на CD14 при ob/ob CD14 -/- мутантни мишки имитира метаболитните и възпалителни ефекти на антибиотиците.

ЗАКЛЮЧЕНИЯ—Това ново откритие показва, че промените в чревната микробиота контролират метаболитната ендотоксемия, възпалението и свързаните с тях нарушения по механизъм, който може да увеличи чревната пропускливост. По този начин би било полезно да се разработят стратегии за промяна на чревната микробиота за контрол, чревна пропускливост, метаболитна ендотоксемия и свързаните с това нарушения.

  • DGGE, денатурираща градиентна гел електрофореза
  • FITC, флуоресцеин изотиоцианат
  • IL, интерлевкин
  • LPS, липополизахарид
  • MDA, малондиалдехид
  • MCP, моноцитен хемотаксичен протеин
  • PAI-1, инхибитор на плазминогенов активатор 1
  • RPL19, рибозомен протеин L19
  • TBARS, вещества, реагиращи с тиобарбитурова киселина
  • TNF-α, фактор на туморна некроза-α
  • ZO-1, zonula occludens-1

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Дванадесетседмични мъжки мишки C57bl6/J (Charles River, Lyon, Франция) и 6-седмични ob/ob (n = 13) мишки (C57bl6 background; The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) бяха настанени в контролирана среда (обърнат 12-часов цикъл на дневна светлина, изключване на светлините в 10:00 ч.) със свободен достъп до храна и вода. Мишките бяха хранени с контрола (n = 13) (A04, Villemoisson sur Orge, Франция) или диета без въглехидрати с високо съдържание на мазнини (с високо съдържание на мазнини, n = 17) в продължение на 4 седмици. Ролята на микрофлората беше изследвана чрез третиране на контролни (контролен антибиотик, n = 13), хранени с високо съдържание на мазнини (антибиотик с високо съдържание на мазнини, n = 17) или мишки ob/ob (ob/ob антибиотик, n = 8) с антибиотици (1,0 g/l ампицилин [Sigma, Сейнт Луис, Мисури] и 0,5 g/l неомицин [Sigma] в питейна вода) през експерименталния период. Ампицилинът и неомицинът са широкоспектърни антибиотици, които се абсорбират слабо (или не се абсорбират, както в случая на неомицин) и следователно без никакви системни ефекти (13). Диетата с високо съдържание на мазнини съдържа 72% мазнини (царевично масло и свинска мас), 28% протеини и -/- мишки, CD14 -/- мишки (C57bl6 фон) се кръстосват с ob +/− и след това се използват двойни хетерозиготи F1 за генериране на ob/ob CD14 -/- и ob/ob генотипове. Всички изброени по-долу експериментални процедури с животни са валидирани от местния комитет по етика, от комитета по етика на болницата в Рангейл и от Université catholique de Louvain.

Извличане на РНК от цекално съдържание.

Бактериалните РНК бяха извлечени от цекалното съдържание с помощта на BioRobot-EZ1 (Qiagen, Hilden, Германия), съгласно инструкциите на производителя. Накратко, съдържанието на цекали се хомогенизира в уред за биене на зърна в продължение на 2 минути в стерилна микроцентрифужна епруветка, съдържаща 0,3 g стъклени топчета и 750 μl QIAzol лизисен реагент. След добавянето на 150 μl хлороформ: изоамилалкохол (24: 1), пробите се завихрят за 15 s и се оставят да престоят за 2-3 минути при стайна температура. И накрая, пробите се центрофугират при 12 000 g за 15 минути при 4 ° C и 300 μl супернатант се зарежда в оборудването BioRobot.

Денатуриращи градиентни профили на гел електрофореза на цекални бактерии.

Бактериалната РНК се усилва чрез RT-PCR, насочена към V3 областта на гена 16S rRNA и използвайки универсалните бактериални праймери HDA1-GC и HDA2 и предварително описана програма (14) (HDA1-GC, 5′-CGCCCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCGGG ′ -GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3 ′). RT-PCR се извършва с помощта на Qiagen едноетапен RT-PCR комплект. Електрофорезата се извършва с DCode апарат (Bio-Rad) и 6% полиакриламидни гелове с 30-55% градиент от 7 mol/l карбамид и 40% (vol/vol) формамид, който се увеличава по посока на електрофорезата. Електрофоретичните проби са в трис-ацетат-EDTA буфер (40 mmol/l Tris, 20 mmol/l оцетна киселина и 1 mmol/l EDTA) при 130 V и 60 ° С за 270 минути. Геловете се оцветяват със SYBR Safe 1 × (Invitrogen) в продължение на 30 минути, изплакват се с дейонизирана вода и се наблюдават чрез UV просветляване. Профилите на денатурираща градиентна гел електрофореза (DGGE) бяха сравнени чрез определяне на коефициента на сходство на Dice и използване на софтуерния пакет Bionumerics (версия 4.01, Applied Maths) при чувствителност 1–2%.

Фекални анализи.

Съдържанието на цекума се суши под вакуум. Остатъкът от несмилаемите въглехидрати, протеини и липиди се определя количествено, както е описано по-горе (15,16). Общото съдържание на LPS се извлича и измерва, както е описано по-горе (17,18).

Количествено количествено определяне на RT-PCR количеството на микробните цекули.

Тестове за толерантност към глюкоза.

Тестовете за орален глюкозен толеранс се извършват, както следва: 6-часови гладни мишки се инжектират с глюкоза чрез сонда (1 g/kg глюкоза, 20% разтвор на глюкоза). Глюкозата в кръвта се определя с глюкомер (Roche Diagnostics, Meylan, Франция) върху 3,5 μl кръв, събрана от върха на вената на опашката. В допълнение, за да се оцени плазмената концентрация на инсулин, се вземат проби от 20 μl кръв 30 минути преди и 15 минути след предизвикване на глюкоза. Плазмата се отделя и замразява при -80 ° C.

Количествена PCR в реално време.

Морфометрия и оцветяване на мастната тъкан.

Средният относителен дял и средната повърхност на адипоцитите се изчислява чрез техника за преброяване на точки върху тъкан, вградена в парафин, както е описано по-горе (4).

Чревна пропускливост in vivo.

Тази мярка се основава на чревната пропускливост за 4000-Da флуоресцентен декстран (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури), както е описано по-рано (19). Накратко, на 6-часови гладни мишки се инжектира флуоресцеин изотиоцианат (FITC) -декстран чрез сондаж (600 mg/kg телесно тегло, 125 mg/ml). След 1 h се събират 120 μl кръв от върха на вената на опашката. Кръвта се центрофугира при 4 ° С, 12 000 g, в продължение на 3 минути. Плазмата се разрежда в равен обем PBS (рН 7.4) и се анализира за концентрация на FITC-декстран с флуоресцентен спектрофотометър (HTS-7000 Plus-плот-четец; Perkin Elmer, Wellesley, MA) при дължина на вълната на възбуждане 485 nm и дължина на вълната на излъчване 535 nm. Стандартните криви за изчисляване на концентрацията на FITC-декстран в пробите са получени чрез разреждане на FITC-декстран в необработена плазма, разредена с PBS (1: 2 [обем/обем]).

Биохимични анализи.

Концентрацията на LPS в плазмата се определя с помощта на комплект, базиран на екстракт от амебоцити Limulus (LAL комплект крайна точка-QCL1000; Cambrex BioScience, Walkersville, MD), където пробите се разреждат 1/40 до 1/100 и се загряват за 10 минути при 70 ° C. В оценката беше включен вътрешен контрол на изчисляването на възстановяването. Концентрацията на инсулин в плазмата се определя в 5 μl плазма с помощта на ELISA комплект (Mercodia, Uppsala, Швеция) и следвайки инструкциите на производителя. Нивото на оксидативен стрес на висцералната мастна тъкан беше оценено чрез измерване на липидно пероксидация и реактивни съединения като малондиалдехид (MDA) и 4-хидроксиноненал, естествени странични продукти на липидната пероксидация. Алдехидните вторични продукти на липидната пероксидация са приети маркери за оксидативен стрес. Реактивните вещества с тиобарбитурова киселина (TBARS) представляват добре установен тест за скрининг и мониторинг на липидната пероксидация. Адуктите, образувани в проби, поради реакцията между MDA с тиобарбитурова киселина, бяха измерени спектрофотометрично. Нивата на TBARS се определят от стандарт за еквивалентност на MDA.

Статистически анализ.

Резултатите са представени като средни стойности ± SE. Статистическата значимост на разликите беше анализирана чрез еднопосочна ANOVA, последвана от post hoc (тест за многократно сравнение на Bonferroni) или корелация на Pearson, използвайки GraphPad Prism версия 4.00 за Windows (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния; www.graphpad.com). Данните с различни горни букви са значително различни (P a ± 0,04 log μg/g; контролен антибиотик, 1,30 b ± 0,26 log μg/g; високо съдържание на мазнини, 0,93 c ± 0,07 log μg/g; антибиотик с високо съдържание на мазнини, 0,02 d ± 0,2 log μg/g). Освен това установихме, че метаболитната ендотоксемия, предизвикана от диети с високо съдържание на мазнини, зависи от механизъм, участващ в контрола на пропускливостта на червата. Демонстрирахме, че храненето с високо съдържание на мазнини драстично увеличава чревната пропускливост (Фиг. 1C) чрез механизъм, свързан с намалена експресия на епителни протеини с плътно свързване като ZO-1 и Occludin (Фиг. 1D – G), въпреки че се наблюдава само тенденция за оклудин. Този ефект е напълно възстановен от антибиотичното лечение. Тези данни предполагат, че чревните бактерии участват в контрола на чревната пропускливост и освен това в появата на метаболитна ендотоксемия.

Лечението с антибиотици намалява появата на възпаление на мастната тъкан, оксидативен стрес и маркери за инфилтрация на макрофаги при мишки, хранени с високо съдържание на мазнини.

Метаболитна ендотоксемия положително корелира с възпаление, оксидативен стрес и маркери за инфилтрация на макрофаги.

За да идентифицираме дали промените в чревната микробиота и метаболитната ендотоксемия контролират възпаление на висцералната мастна тъкан, оксидативен стрес и инфилтрация на макрофаги, извършихме множество корелационни анализи между тези параметри. Метаболитната ендотоксемия положително и значително корелира с PAI-1, IL-1, TNF-α, STAMP2, NADPHox, MCP-1 и F4/80 mRNA (фиг. 4A-C; допълнителна фиг. 1, която е подробно описана онлайн приложение [достъпно на http://dx.doi.org/10.2337/db07-1403]). Със същата цел, ние направихме други корелации и установихме, че всички маркери за възпаление, оксидативен стрес и инфилтрация на макрофаги са положително и значително корелирани помежду си (фиг. 4D – I). Като цяло тези множество корелации поддържат силна връзка между чревна микробиота, ендотоксемия, възпаление и оксидативен стрес по време на диетично хранене с високо съдържание на мазнини.

Лечението с антибиотици предотвратява хипертрофия на адипоцити, предизвикана от диета с високо съдържание на мазнини.

Преди това съобщихме, че диетата с високо съдържание на мазнини увеличава размера на клетките на адипоцитите (4) и тук потвърждаваме тези данни (фиг. 5А, В и D). Освен това предположихме, че това може да се дължи на LPS-зависим механизъм (4). Затова се чудехме дали намалената метаболитна ендотоксемия, предизвикана от антибиотичното лечение, е свързана с промени в размера на адипоцитните клетки. Средният размер на адипоцитите е намален при третирани с високо съдържание на мазнини мишки, третирани с антибиотици, в сравнение с необработени мишки с високо съдържание на мазнини (Фиг. 5А, В и D). Тези промени бяха придружени с по-ниска клетъчна плътност в сравнение с всички групи (фиг. 5С).

Лечението с антибиотици подобрява метаболитните параметри на диабета и затлъстяването при мишки, хранени с високо съдържание на мазнини.

Антибиотично лечение на ob/ob мишки намалява ендотоксемията.

За да оценим приноса на чревната микробиота за развитието на метаболитна ендотоксемия и възпаление, независимо от храненето с високо съдържание на мазнини, се обърнахме към ob/ob мишки. Тези животни се характеризират с по-висок възпалителен тонус и концентрация на LPS в плазмата, докато консумират нормална чау (23). Почти не са открити бактериални РНК в нито едно от цекусните съдържания на ob/ob мишки, лекувани с антибиотици, като по този начин се предполага, че подобно на мишки с високо съдържание на мазнини, антибиотичното лечение е имало драматичен ефект върху ob/ob чревната микробна популация. Това може да се дължи на увеличения прием на храна, а следователно и на приема на антибиотици. Количественото определяне на бактериите потвърждава профила на DGGE и показва значително намаляване на Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. И Bacteroides-Prevotella spp. (Маса 1). Освен това, нашите данни показват, че лечението на ob/ob мишки намалява метаболитната ендотоксемия (фиг. 7А и В). Въпреки това, ендотоксемията все още остава по-висока от контролните стойности.

Антибиотично лечение на ob/ob мишки понижи концентрацията на иРНК на възпалителни маркери на мастната тъкан и метаболитни параметри на диабет и затлъстяване.

Концентрациите на тРНК на PAI-1 и F4/80 са значително намалени във висцералните мастни депа и в по-малка степен в подкожните мастни депа на об/об мишки, лекувани с антибиотици (фиг. 7Н, I, L и M). По същия начин, висцералните мастни депо липидни пероксиди, маркери на оксидативен стрес, са двойно по-ниски при мишки, лекувани с антибиотици (фиг. 7N). Освен това, непоносимостта към глюкоза (фиг. 7С), индексът на инсулинова резистентност (фиг. 7F), индуцираната от глюкоза секреция на инсулин (фиг. 7Е) и теглото на висцералната и подкожната мастна тъкан (фиг. 7J и К) са намалени от антибиотичното лечение . Въпреки това не е установена значителна промяна в телесното тегло (Фиг. 7G).

Липсата на LPS рецептор CD14 частично връща възпалителни маркери и метаболитни параметри при ob/ob мишки.

Ние и други по-рано демонстрирахме, че липсата на LPS рецептор предпазва от възпаление на мастната тъкан, предизвикано от мазнини и метаболитни нарушения (4,24-28). За да се демонстрира, че LPS рецепторът може да участва във възпалителния фенотип на ob/ob мишки, генерирахме ob/ob CD14 -/- мишки. Тук показахме, че при ob/ob CD14 -/- мишки, концентрациите на PAI-1 и F4/80 иРНК са намалени във висцералните мастни депа (Фиг. 7Н и L). Това беше придружено от намаляване на маркерите на оксидативен стрес (фиг. 7N). Всички тези параметри остават непроменени в подкожното мастно депо в сравнение с ob/ob мишки, показващи, че CD14-медиираното възпаление е насочено към висцералната мастна тъкан. Освен това, профилите на глюкоза в кръвта, индекс на инсулинова резистентност, индуцирана от глюкоза секреция на инсулин, тегла на висцералната и подкожната мастна тъкан и пероксидацията на липидите са намалени в ob/ob CD14 -/- в сравнение с ob/ob мишки (Фиг. 7C – N).

ДИСКУСИЯ

Тук съобщихме, че чревните бактерии участват в диетата с високо съдържание на мазнини и об/ob-индуцирана метаболитна ендотоксемия, възпаление на мастната тъкан и метаболитни нарушения. Този ефект може да бъде медииран от механизъм, който може да увеличи пропускливостта на червата и да подобри абсорбцията на LPS. Лечението с антибиотици значително понижава плазмените нива на LPS, пропускливостта на червата и появата на висцерално възпаление на мастната тъкан, оксидативен стрес, инфилтрация на макрофаги и метаболитни нарушения. Следователно заключаваме, че чревната микробиота би могла да контролира чревната пропускливост, което определя прага, при който се появяват метаболитни нарушения, предизвикани от метаболитна ендотоксемия.

В търсенето на независими от червата източници на ендотоксемия, пародонтитът може да бъде свързан и с развитието на метаболитни нарушения (44). Няколко проучвания съобщават, че лечението на пародонтоза с антибиотици е свързано с подобрени метаболитни параметри (45). Независимо от това, въздействието на такова антибиотично лечение върху чревната микробиота не е изследвано, но може да играе роля в подобрения метаболитен фенотип.

В обобщение, първо, ние демонстрирахме, че при мишките, хранени с високо съдържание на мазнини, модулацията на чревната микробиота е свързана с повишена чревна пропускливост, която предшества развитието на метаболитна ендотоксемия, възпаление и свързаните с това разстройства (Фиг. 8). Второ, открихме, че при ob/ob мишките чревната микробиота определя концентрацията на LPS в плазмата и е механизъм, участващ в метаболитните нарушения. Като цяло ние демонстрираме, че чревната микробиота определя прага за метаболитна ендотоксемия.