Редактирано от Джеф Хасти, Калифорнийски университет, Сан Диего, Ла Хола, Калифорния, и прието от редакционната колегия на 22 декември 2015 г. (получено за преглед на 21 юли 2015 г.)

ендогенния

Значимост

Болестта на Грейвс се причинява от автоантитела, които активират рецептора на тироид-стимулиращия хормон (TSH) и предизвикват хронично повишаване на нивата на тиреоидния хормон. Настоящите възможности за лечение остават непроменени в продължение на десетилетия и включват антитиреоидни лекарства, както и лечение с радиойод и тиреоидектомия, които водят до унищожаване на щитовидната жлеза и изискват доживотно предписване на хормони на щитовидната жлеза. Проектирахме генетична верига със затворен цикъл, която позволява на инженерните клетки да следят повишените нива на хормоните на щитовидната жлеза и да стимулират експресията на валидиран антагонист на TSH рецептор, който се конкурира с TSH, както и автоантитела на TSH рецептор, като по този начин преодолява патофизиологичното активиране на щитовидната жлеза. Хипертиреоидните животни, имплантирани с тези дизайнерски клетки, са коригирали нивата на щитовидния хормон чрез възстановяване на системата за обратна връзка на оста хипоталамус-хипофиза-щитовидна жлеза.

Резюме

Проектиране и валидиране на синтетичен тироиден хормон-реагиращ генен превключвател

Ефект на хормоните на щитовидната жлеза (Т3 и Т4) върху SEAP производството на клетки CHO-K1. Клетките CHO-K1 бяха котрансфектирани с pcDNA3.1 и pSP30 (PUAS5-SEAP-pA) или pcDNA3.1 и pSEAP2-контрол (PSV40-SEAP-pA), а производството на SEAP беше профилирано в културалната супернатанта 24 часа след добавянето на хормони на щитовидната жлеза Т3 или Т4. Данните са средно ± SD на три независими експеримента, направени в три екземпляра.

Ефект на свръхекспресията на TSR и DIO2 върху жизнеспособността на клетките CHO-K1. CHO-K1 клетките бяха котрансфектирани с pcDNA3.1 и или pSP27 (PhCMV-TSR-pA), или pDIO2 (PSV40-DIO2-pA) и клетъчната жизнеспособност беше оценена след 24 часа чрез FACS анализ, използвайки Calcein AM Viability Dye. Като контрол се използват нетрансфектирани CHO-K1 клетки.

Базиран на FACS анализ на ефективността на трансфекция на клетки CHO-K1. Сравнителен поточен цитометричен анализ на клетки CHO-K1 24 часа след трансфекция с pEGFP-N1. Като контрол се използват нетрансфектирани CHO-K1 клетки. FSC-A е импулсна зона на разсейване напред.

Характеризиране на задействания от щитовиден хормон трансгенен експресиране

Характеризиране на експресията на трансгена, предизвикана от хормони на щитовидната жлеза. (A) Зависим от дозата SEAP профил на експресия за TSR-SEAP-трансгенни (pSP27/pSP30) CHO-K1 клетки в присъствието на нарастващи концентрации на T3 и след 24 часа. (B) Обратимостта на експресията на SEAP, реагираща на T3 на хормона на щитовидната жлеза, се оценява чрез култивиране на TSR-SEAP-трансгенни (pSP27/pSP30) CHO-K1 клетки в продължение на 72 h, като се редуват нивата на T3 (3 nM) на всеки 24 h. (C) Фина настройка на веригата на TSR сензор за клетки CHO-K1, котрансфицирани с pSP27 (PhCMV-TSR-pA) и pSP28 (PUAS1-SEAP-pA), pSP29 (PUAS2-SEAP-pA), pSP30 (PUAS5-SEAP -pA), pSP50 (PUAS2.1-SEAP-pA), pSP51 (PUAS5.1-SEAP-pA) или pSP52 (PUAS3-SEAP-pA) при наличие на нарастващи концентрации на T3 и след 24 часа. За целите на сравнението данните от А бяха възпроизведени. (D) Зависим от дозата SEAP профил на експресия за TSR-SEAP-трансгенни (pSP27/pSP30) CHO-K1 клетки, котрансфектирани с DIO2 (pDIO2) или pcDNA3.1 в присъствието на нарастващи концентрации на T4 и след 24 часа. Индукционна кинетика на (E) TSR-цитрин-трансгенни (pSP27/pSP35) клетки CHO-K1 и (F) TSR-SEAP-трансгенни (pSP27/pSP30) клетки CHO-K1, изложени на 3 nM T3. Данните са средните стойности ± SD на три независими експеримента, направени в три екземпляра. (Скала: 100 μm.)

Затворен контур за контрол на секрецията на TSHAntag от устройството за датчик на хормона на щитовидната жлеза

За да контролираме автономно хомеостазата на хормона на щитовидната жлеза по самодостатъчен начин, ние свързахме сензорното устройство TSR с експресията на конструиран TSHAntag с висок афинитет, който се конкурира с ендогенен TSH за TSHR-свързващото място (25). TSHAntag е конструиран вариант на човешки TSH, съдържащ човешки хорион гонадотропин-β С-терминален пептиден линкер между β- и α-веригите, както и две мутирали места на гликозилиране (18). Секрецията на TSHAntag (pSP32, PhCMV-TSHAntag-pA) е потвърдена чрез ELISA в няколко клетъчни линии на бозайници. Клетките CHO-K1, които показват най-добрия профил на индукция на трансгена, също ефективно секретират TSHAntag в хранителната среда (фиг. 3А). RT-PCR и ELISA потвърждават бързото T3-задействано производство и освобождаване на TSHAntag от CHO-K1 клетки, котрансфектирани с pSP27 (PhCMV-TSR-pA) и pSP34 (PUAS5-TSHAntag-pA) (Фиг. 3 B и C). Функционалността на TSHAntag е потвърдена чрез стандартен клетъчен анализ (26), който потвърждава инхибирането на TSHR активирането, когато се стимулира от говежди тиреостимулиращ хормон (bTSH) (27) или човешко тиреостимулиращо автоантитело (M22) (28) ( Фиг. 3D).

Характеризиране на TSHAntag in vitro. (A) Профилиране на секреция на TSHAntag от различни клетъчни линии на бозайници, трансфектирани с конститутивен TSHAntag експресионен вектор pSP32 (PhCMV-TSHAntag-pA) и след 48 часа с използване на ELISA. (B) RT-PCR-базирано експресионно профилиране на TSHAntag от TSR-TSHAntag-трансгенни (pSP27/pSP34) CHO-K1 клетки, индуцирани с 3 nM T3. (C) TSHAntag секреция профилиране на TSR-TSHAntag-трансгенни (pSP27/pSP34) CHO-K1 клетки, индуцирани с 3 nM T3. (D) Стабилни експресиращи TSHR клетки CHO-K1 бяха трансфектирани с pSP16 (PCREm-SEAP-pA), инкубирани с кондиционирана среда, съдържаща различни количества TSHAntag, и предизвикани с 50 μIU/ml bTSH или 20 ng/ml M22 преди нивата на SEAP са били профилирани в супернатантата на културата. Данните са средните стойности ± SD на три независими експеримента, направени в три екземпляра. n.d, не се открива.

Възстановяване на нивата на еутиреоиден хормон в миши модел на експериментална гробна болест

Материали и методи

Компоненти на щитовидните сензори-ефекти.

Изчерпателни подробности за дизайна и конструкцията за всички вектори на изразяване са дадени в таблица S1. Основните плазмиди са както следва: pSP27 кодира конститутивно експресиран хибриден щитовиден сензор (PhCMV-TSR-pAbGH), pSP30 кодира експресионна единица SEAP на тиреоиден хормон (PUAS5-SEAP-pASV40) и pSP34 кодира експресия на TSHAntag, реагираща на хормона на щитовидната жлеза единица (PUAS5-TSHAntag-pASV40).

Плазмиди и олигонуклеотиди, използвани и проектирани в това проучване

Клетъчна култура и трансфекция.

Човешки мезенхимни стволови клетки, трансгенни за човешката теломераза [hMSC-TERT (44)] каталитична субединица, HEK (HEK-293T; ATCC: CRL-11268), човешки цервикални аденокарциномни клетки (HeLa; ATCC: CCL-2) и човешки фибросарком клетки (HT-1080; ATCC: CCL-121) са култивирани в DMEM (Invitrogen), допълнена с 10% (обем/обем) FCS (партиден номер PE01026P; Bioconcept) и 1% (обем/обем) разтвор на пеницилин/стрептомицин ( Sigma-Aldrich) при 37 ° C във влажна атмосфера, съдържаща 5% CO2. CHO клетки (CHO-K1; ATCC: CCL-61) бяха култивирани в среда за проследяване с висока производителност (HTS) на ChoMaster (Cell Culture Technologies GmbH), съдържаща 5% (обем/обем) FCS и 1% пеницилин/стрептомицин. За трансфекция на hMSC-TERT, HEK-293T, HeLa, HT-1080 и CHO-K1, 2 × 10 5 клетки се посяват на гнездо от шест ямкова плака 24 часа преди трансфекцията и се инкубират в продължение на 12 часа с 400 µL ДНК-PEI (полиетилениминова) смес, получена чрез инкубиране на 6 µL PEI за hMSC-TERT и HEK-293T и 12 µL PEI за HT-1080, HeLa и CHO-K1 (PEI 6 pcDNA3.1/pSP27/pDIO2-котрансфектирани CHO-K1 клетки се инкубират в продължение на 30 минути с 20 nM Calcein AM Dye при 22 ° C. Пробите се промиват два пъти с PBS преди FACS анализ.

Тест за активиране на TSHR, базиран на клетки.

Клетките CHO-K1, стабилно експресиращи TSHR, бяха трансфектирани с pSP16 (PCREm-SEAP-pA) и инкубирани с кондиционирана среда (ChoMaster HTS с 1% пеницилин/стрептомицин), съдържаща различни количества TSHAntag с bTSH или M22 антитяло за 48 h, и SEAP експресия е профилиран в супернатанта, както е описано по-горе.

Количествена RT-PCR.

Обща РНК се екстрахира от pSP27/pSP34-трансгенни CHO-K1 клетки, използвайки ZR RNA MiniPrep Kit (Zymo Research) и TURBO DNase (Invitrogen). RT-PCR в реално време се извършва с помощта на комплект за обратна транскрипция на cDNA с висок капацитет (Applied Biosystems) и SYBR Green PCR Master Mix (Invitrogen) с направени по поръчка праймери (напред: 5′-TTAATGGCAAGCTGTTCCTG-3 ′; обратен: 5 ′ -ACTTGCATGACAGAGCGACT-3 ′). Eppendorf Realplex Mastercycler (Eppendorf GmbH) е настроен на следните параметри на усилване: 2 минути при 50 ° C, 20 s при 95 ° C и 40 цикъла от 1 s при 95 ° C, последвани от 1 min при 60 ° C. Експресията на ендогенен GAPDH се използва като вътрешен контрол.

FACS на трансгенни клетки CHO-K1.

За FACS анализ, pEGFP-N1/pcDNA3.1/pSP27/pDIO2-трансгенни CHO-K1 клетки се отделят, използвайки 0,5 ml StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent (Invitrogen). Клетъчните популации бяха анализирани с помощта на потоков цитометър Becton Dickinson LSRII Fortessa (Becton Dickinson), оборудван за FITC/EGFP (488 nm лазер, 505 nm филтър за дълъг проход и 530/30 емисионен филтър) за откриване и настроен да изключва мъртвите клетки и клетъчни дублети. За анализ на жизнеспособността, използващ Calcein AM Dye, бяха включени всички клетки.

Експерименти с животни.

Статистически анализи.

Данните in vitro представляват средните стойности ± SD на три независими експеримента с три проби на експеримент. Данните in vivo представляват средните стойности ± SEM на осем животни. Груповите сравнения бяха анализирани чрез t тест на Student (прекъсване на P 1 Настоящ адрес: Отдел по ендокринология и диабет, Stadtspital Triemli, CH-8063 Цюрих, Швейцария.

Принос на автора: P.S., G.C.-E.H., M. Folcher, H.Z. и M. Fussenegger, проектирани изследвания; P.S. и G.C.-E.H. извършени изследвания; P.S., M. Folcher, H.Z. и M. Fussenegger анализираха данни; и P.S., M. Folcher, H.Z. и M. Fussenegger са написали статията.

Авторите не декларират конфликт на интереси.

Тази статия е PNAS директно подаване. J.H. е гост-редактор, поканен от редакционния съвет.

Безплатно достъпен онлайн чрез опцията PNAS с отворен достъп.