Абдо Махли

1 Институт по биохимия (Emil-Fischer Zentrum), Университет Фридрих-Александър, Ерланген-Нюрнберг, Fahrstr. 17, D-91054 Ерланген, Германия; [email protected] (А.М.); [email protected] (T.S.); [email protected] (K.F.)

приложение

Татяна Сейц

1 Институт по биохимия (Emil-Fischer Zentrum), Университет Фридрих-Александър, Ерланген-Нюрнберг, Fahrstr. 17, D-91054 Ерланген, Германия; [email protected] (А.М.); [email protected] (T.S.); [email protected] (K.F.)

Ким Фрийз

1 Институт по биохимия (Emil-Fischer Zentrum), Университет Фридрих-Александър, Ерланген-Нюрнберг, Fahrstr. 17, D-91054 Ерланген, Германия; [email protected] (А.М.); [email protected] (T.S.); [email protected] (K.F.)

Ян Франк

2 Институт по хранителни науки, Университет в Хохенхайм, Гарбенстр. 28, D-70599 Щутгарт, Германия; [email protected]

Ралф Вайскирхен

3 Институт по молекулярна патобиохимия, експериментална генна терапия и клинична химия (IFMPEGKC), Университетска болница RWTH Аахен, D-52074 Аахен, Германия; ed.nehcaaku@nehcriksiewr

Мона Абдел-Таваб

4 Централна лаборатория на немските фармацевти, ул. Карл-Маних. 20, D-65760 Ешборн, Германия; [email protected]

Дариуш Бехнам

5 AQUANOVA AG, Birkenweg 8-10, D-64295 Дармщат, Германия; [email protected]

Клаус Хелербранд

1 Институт по биохимия (Emil-Fischer Zentrum), Университет Фридрих-Александър, Ерланген-Нюрнберг, Fahrstr. 17, D-91054 Ерланген, Германия; [email protected] (А.М.); [email protected] (T.S.); [email protected] (K.F.)

Резюме

1. Въведение

Терминът „метаболитен синдром“ се отнася до едновременната поява на няколко съпътстващи заболявания, свързани със затлъстяването. В допълнение към инсулиновата резистентност с произтичащия от това захарен диабет тип 2 (T2DM), дислипидемията и хипертонията са компоненти на метаболитния синдром. Освен това в почти всички случаи затлъстяването е свързано със значително натрупване на липиди в черния дроб. Тази форма на чернодробна стеатоза се определя като неалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD) и днес се разглежда като чернодробна проява на метаболитния синдром. NAFLD обхваща широк спектър от патологични състояния. Хепатоцелуларното натрупване на липиди е първата патологична стъпка на NAFLD. Простата стеатоза може да прогресира с възпаление до (безалкохолен) стеатохепатит (NASH). В напредналата си форма NASH се характеризира с некроинфламация и прогресивна фиброза [1]. Последният може да прогресира до цироза. Днес NAFLD е призната за най-често срещаното чернодробно заболяване в западните страни [2].

Всяка патологична стъпка на NAFLD е следствие и се задейства съответно от (компоненти на) метаболитния синдром. С това подобряването (компонентите на) метаболитния синдром също подобрява NAFLD.

Понастоящем няма налични ефективни стратегии за лечение на NAFLD. По-голямата част от пациентите не реагират добре на интервенции за отслабване [3]. Хирургичните интервенции като стомашен байпас или намаляване на стомаха (бариатрична хирургия) са най-ефективните мерки за трайна загуба на тегло [4], които също влияят положително върху развитието и прогресията на NAFLD [5]. Въпреки това, също така в светлината на инвазивността и разходите, тези хирургични интервенции са приложими само за малцинство от патологично затлъстели индивиди. От друга страна, фармакологичните терапии за T2DM (например със сулфонилурея, метформин или GLP-1 агонисти) често са само частично ефективни и страдат от тежки странични ефекти [6]. Следователно има голяма клинична необходимост от нови фармакологични терапевтични подходи за устойчива безопасна загуба на тегло и за дългосрочно подобряване на (симптомите на) метаболитен синдром.

Ксантохумолът (3 '- [3,3-диметил алил] -2', 4 ', 4-трихидрокси-6'-метоксихалкон) е основният пренилиран халкон на женските съцветия (шишарки от хмел), присъстващ в малки количества в бирата [ 7]. Съобщени са няколко полезни за здравето ефекти на ксантохумола, като химиопрофилактични и противовъзпалителни действия (прегледани в [8]). Съвсем наскоро е показано, че ксантохумолът намалява адипогенезата и подобрява метаболизма на липидите и глюкозата при миши модели на хиперлипидемия, затлъстяване и T2DM [9,10,11]. Освен това по-рано показахме, че ксантохумолът инхибира чернодробното възпаление и фиброзата при миши модели на NAFLD [12]. Освен това ние и други установихме, че ксантохумолът инхибира чернодробното възпаление и фиброзата също при модели на хепатоцелуларни увреждания, които не са свързани с метаболитния синдром [13,14,15]. Това показва, че ксантохумолът проявява и директен инхибиторен ефект върху възпалителните и фиброгенните механизми в черния дроб (клетките).

Забележително е, че във всички тези проучвания XN се прилага от началото на експеримента, т.е. едновременно с въвеждането на обезогенна или индуцираща NAFLD диета, която симулира профилактика на заболяванията. Това обаче не отразява положението на пациентите със затлъстяване, които вече страдат от медицински състояния при започване на подобряващи интервенции. Освен това, въпреки обещаващите ефекти върху здравето, терапевтичната употреба на XN може да бъде ограничена от лошата му орална бионаличност [16].

В настоящото проучване имахме за цел да анализираме ефекта на мицеларна солюбилизация на ксантохумол (s-XN) в предклиничен миши модел на диета, индуцирано затлъстяване, диабет и NAFLD [17]. Въз основа на предишни проучвания, успешно използващи мицеларна солюбилизация на други полифеноли за повишаване на тяхната бионаличност през устата [18,19,20,21], ние избрахме дневна доза от 2,5 mg/kg BW, т.е. над 10 пъти по-ниска от ефективната дози, съобщени в предишни проучвания in vivo. За сравнение, ние също приложихме същата доза ксантохумол в естествената му форма (n-XN). За разлика от повечето предишни проучвания, ксантохумолът не се прилага чрез (смесване в) чау, а чрез ежедневен орален сондаж, за да се гарантира точното дозиране. Освен това, мишките са били хранени с индуцираща затлъстяване и NAFLD диета от западен тип (WTD) вече 3 седмици преди началото на приложението на ксантохумол, за да симулират терапевтична намеса, а не превенция.

2. Материали и методи

2.1. Химикали

Micellar Xantho-Flav-Solubilisate (EW0192/B, 10% v/v; s-XN) и естествен екстракт от ксантохумол (92% m/m; n-XN) са предоставени от AQUANOVA AG (Дармщат, Германия). За разтваряне на нативния ксантохумол се приготвя воден разтвор на метил хидроксипропил целулоза (MHPC, 0,2%, Methocel E4M Premium CR, Hypromellose 2910 USP, Fagron Inc., St. Paul, MN, USA).

2.2. Животни и животински модел

Осемседмични мъжки мишки C57BL/6 (Charles River Laboratories; Sulzfeld, Германия). Мишките бяха настанени в контролирана от 22 ° C стая под 12-часов цикъл светлина-тъмнина със свободен достъп до храна и вода. Експерименти с жилища и животни бяха извършени съгласно националните и международни насоки на Европейския съюз (ЕС) със съответното разрешение на местното правителство (55.2-2532-2-196). След 1 седмица на аклиматизация, мишките бяха разделени на четири групи (6 мишки на група); мишките са били хранени или със стандартна диета (контрол), или със западен тип диета (WTD) в продължение на три седмици. Стандартната диета съдържа 4,9% сурови фибри, 6,4% сурова пепел, 19% суров протеин, 3,3% мазнини и 58% въглехидрати (захароза 4,7% и нишесте 36,5%); WTD беше обогатен със свинска свинска мас (15%), телешки лой (15%), палмитинова киселина (4%), стеаринова киселина (4%), холестерол (0.2%) и захароза (30%) [17]. И двете диети за гризачи са изготвени от Ssniff (Soest, Германия).

Впоследствие, хранени с WTD мишки бяха третирани или с n-XN, или s-XN, или с носител (VH) на орален сонда дневно в продължение на допълнителни 8 седмици. След общо 11 седмици контрол или хранене с WTD, мишките бяха умъртвени и проби от чернодробна тъкан и кръв бяха събрани за допълнителен анализ.

2.3. Тест за толерантност към интраперитонеална глюкоза (ipGTT)

След 7 седмици перорално приложение на n-XN или s-XN, ipGTT се извършва, както е описано по-горе [22]. Накратко, след 12-часово гладуване, мишките се инжектират интраперитонеално с глюкоза (50% w/v разтвор, 3 mg (глюкоза)/g телесно тегло). Концентрациите на глюкоза в кръвта се измерват в проби, взети от опашната вена преди (глюкоза на гладно) и 30, 60, 90 и 120 минути след прилагане на глюкоза с помощта на глюкомер Accutrend (Roche, Mannheim, Германия).

2.4. Анализ на клетъчното съдържание на липиди

Чернодробните липиди бяха извлечени и нивата на триглицеридите бяха количествено определени с помощта на GPO-триглицериден комплект (Sigma, Deisenhofen, Германия), както е описано [23,24].

2.5. Анализ на експресията на РНК

Изолирането на РНК от чернодробните тъкани и обратната транскрипция се извършват, както е описано [25]. Количествената PCR в реално време е извършена с помощта на технологията LightCycler (Roche) [26] и следните двойки праймери: Миши колаген I (напред: 5′-CTG TTC CAG GCA ATC CAC GA -3 ′; обратен: 5′-ATC AGC TGG AGT TTC CGT GC-3 ′), миши cxcl1 (напред: 5′-ACC GAA GTC ATA GCC ACA CTC-3 ′; реверс: 5′-CTC CGT TAC TTG GGG ACA CC-3 ′), миши mcp1 ( напред: 5′-TGC AGG TCC CTG TCA TGC TTC-3 ′; заден ход: 5′-TGG ACC CAT TCC TTC TTG GGG T-3 ′) и миши α-SMA (напред: 5′-CCA GCC ATC TTT CAT TGG GAT-3 ′; реверс: 5′-CCC CTG ACA GGA CGT TGT TA-3 ′). За нормализиране е използвано усилване на cDNA, получена от 18s rRNA (напред: 5′-AAA CGG CTA CCA CAT CCA AG-3 ′; обратна: 5′-CCT CCA ATG GAT CCT CGT TA-3 ′) за нормализиране.

2.6. (Имуно) Хистологични анализи

За хистологични анализи проби от тъкани на миши черен дроб се фиксират за 24 часа в 4% формалин при стайна температура, дехидратират се със сортиран етанол и се влагат в парафин. Тканевите срезове (с дебелина 5 µm) бяха депарафинизирани с ксилол и оцветени с хематоксилин и еозин. Имунохистохимичното оцветяване се извършва с използване на анти-CD3 C7930 антитяло (1: 500; Sigma-Aldrich), както е описано [27]. Броят на CD3-положителните хепатоцити се отчита в 4 произволно избрани области на всяка секция. Чернодробното имунохистохимично оцветяване за α-SMA се извършва, както е описано [17].

2.7. HPLC анализ на XN в серумни проби

Ксантохумолът е анализиран, както е описано по-рано [7] с малки модификации, за да позволи използването на по-големи обеми серум поради ниските концентрации в кръвта на аналитите. Накратко, серумни проби, в два екземпляра, бяха коригирани до рН 4,5–5,0 с 6 N солна киселина. Аскорбинова киселина (12,5 μL 10% аскорбинова киселина във вода; тегло/обем) се добавя, за да се предотврати окисляването. Серумът (1,5 ml) се инкубира с 25 μL β-глюкуронидаза тип H-1 от Helix pomatia (3 mg/100 µL в 0,1 М натриев ацетатен буфер, рН 4,5; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Германия) на тъмно при 37 ° C за 1 h с леко разклащане (

100 об/мин). Пробите се екстрахират два пъти с 4 ml етилацетат чрез смесване в продължение на 20 минути на вертикален ротатор. Пробите бяха центрофугирани при 1690 × g в продължение на 5 минути при 4 ° С между смесването и бяха събрани общо 7.2 ml супернатант. Събраните супернатанти се изпаряват до сухо при 10 mbar, като се използва RVC 2-33 IR центробежен изпарител (Martin Christ Gefriertrockungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Германия). Изсушените остатъци се разтварят в 100 µL метанол и се смесват вихрово два пъти, с 10 минути почивка при стайна температура между тях и 10 µL се инжектират в HPLC.

Ксантохумолът беше хроматографиран на система JASCO HPLC (LC Net II ADC, AS-2059-SF Plus, PU-2080 Plus, интелигентен термостатен колон CO-2060 Plus, DG-2080-53, LG-2080-02 и детектор с фотодиодни решетки PDA MD-2018; JASCO, Groβ-Umstadt, Германия), оборудвана с Kinetex PFP колона (Kinetex PFP, размер на порите 100 Å, 250 × 4,6 mm (дължина × диаметър), размер на частиците 5 μm; Phenomenex), поддържана при 35 ° C . Подвижна фаза А (дейонизирана вода с 5% мравчена киселина) и подвижна фаза В (ацетонитрил с 10% дейонизирана вода и 5% мравчена киселина) се доставят при скорост на потока 1,0 ml/min след многостепенен метод на градиент (0 min 0% B, 1 min 30% B, 4 min 30% B, 12 min 75% B, 14 min 100% B, 20 min 30% B). Елуентът се наблюдава чрез откриване на фотодиодна решетка при 292 nm със спектри, получени в диапазона от 220 до 850 nm. Пиковете бяха записани и интегрирани с помощта на ChromNav версия 1.19.1 (JASCO) и количествено определени чрез сравняване на зоните на пиковете с тези на автентичните външни стандарти.