Резюме

Заден план

Влиянието на хранителния статус и хранителния състав върху митохондриалното окислително фосфорилиране (OXPHOS) при рибите остава до голяма степен неизвестно. За да идентифицираме биомаркери, представляващи интерес за хранителни изследвания, тук получихме транскриптом с дълбоко покритие чрез 454 пиросеквениране на чернодробни и скелетни мускули, нормализирани библиотеки от cDNA от дългосрочно огладняла ореда (Sparus aurata) и риби, хранени с различни диети.

Резултати

След почистване на високопроизводителни отчитания за дълбоко секвениране, 699 991 и 555 031 висококачествени четения позволиха de novo сглобяване на чернодробни и скелетни мускулни последователности, съответно (средна дължина: 374 и 441 bp; обща мегабаза: 262 и 245 Mbp). Допълнително постепенно сглобяване беше завършено чрез интегриране на данни от двете тъкани (хибридно сглобяване). Сглобяването на хибридни, чернодробни и скелетни мускулни транскриптоми дава съответно 19 530, 11 545 и 10 599 изотига (средна дължина: съответно 1330, 1208 и 1390 bp), които са групирани в 15 954, 10 033 и 9189 изогрупи. След анотация, хибридни транскриптомични данни бяха използвани за конструиране на олигонуклеотиден микрочип за анализ на хранителната регулация на експресията на 129 гена, участващи в OXPHOS в S. aurata. Гладните регулирани компоненти на цитохром с оксидаза и други ключови OXPHOS гени в черния дроб, които проявяват по-висока чувствителност към лишаване от храна, отколкото скелетните мускули. Съставът на диетата обаче повлиява OXPHOS в скелетната мускулатура в по-голяма степен, отколкото в черния дроб: повечето гени, регулирани под глад, показват по-висока експресия сред рибите, хранени с високо съдържание на въглехидрати и ниско съдържание на протеини.

Заключения

Нашите открития показват, че експресията на коензим Q-свързващ протеин (COQ10), цитохром с оксидазна субединица 6A2 (COX6A2) и ADP/ATP транслоказа 3 (SLC25A6) в черния дроб и цитохром с оксидазна субединица 5B изоформа 1 (COX5B1) в черния дроб и скелетната мускулатура, са чувствителни маркери на хранителното състояние, които могат да бъдат от значение за оценка на ефекта от промените в режима на хранене и състава на диетата върху рибовъдството.

Заден план

Основно предимство на технологията за секвениране от следващо поколение (NGS) е способността да се предоставят огромно количество данни за генна експресия поради нейната висока производителност [1,2,3]. Сред подходите на NGS масивното 454 секвениране се превърна в осъществим метод за увеличаване на дълбочината и покритието на секвенцията. Следвайки метода на пиросеквениране [4], нивата на грешки в секвенирането в платформата 454 са ниски (

Методи

Животни, опити за хранене, вземане на проби и ефективност на растежа

Извличане на РНК, изграждане на cDNA библиотека, нормализиране и 454 секвениране

Обща РНК се извлича от 30 mg черен дроб или бял скелетен мускул, като се използват съответно мини китове RNeasy и RNeasy фиброзна тъкан (Qiagen, Hilden, Германия), съгласно инструкциите на производителя. Концентрацията и чистотата на РНК се определят спектрофотометрично при 260/280 nm, като се използва Nanodrop ND-1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA). Целостта на РНК се определя с биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). За последващи изследвания са използвани само проби с RNA Integrity Number (RIN)> 9.2. Басейни, състоящи се от 1 μg обща РНК, изолирана от 6 индивида на състояние (гладуване и хранене с диети HLL, MHL, MLH, LHH и LLH; общо 36 проби от риби и РНК) бяха използвани за изграждане на библиотеки за cDNA на черния дроб и белите скелетни мускули. Синтезът на dsDNA беше извършен с помощта на MINT-Universal cDNA синтез комплект (Evrogen, Москва, Русия). За да се увеличи присъствието на редки транскрипти, библиотеките на cDNAs бяха нормализирани с помощта на комплекта за нормализация на cDNA TRIMMER (Evrogen, Москва, Русия), следвайки инструкциите на производителя. Последователността на библиотеките на cDNAs беше извършена с помощта на платформа GS FLX 454 (Рош, Базел, Швейцария) в CCiTUB на Университета в Барселона (Барселона, Испания).

Сбор на транскриптом и анотация

Предварителната обработка на сурови четения за премахване на нискокачествени основи, грундове и адаптери и контрол на качеството бяха извършени с помощта на Cutadapt [35], Prinseq [36] и FastQC (Babraham Bioinformatics, Cambridge, UK). Четенията бяха ново събрани с помощта на софтуера GSAssembler (Roche, Базел, Швейцария). Бяха извършени три сглобявания: едно за данни за последователността от черния дроб, друго за белите скелетни мускули и постепенно сглобяване, използващо данни за черния дроб и белите скелетни мускули (хибридно сглобяване). Анотирането на гени на уникални последователности за трите комплекта беше извършено с локални търсения на BLASTx и BLASTn срещу бази на несъкратени протеини и нуклеотидни последователности на QBLAST на NCBI с помощта на GPRO софтуер [37] със значителен праг на Е-стойност 30. Анализ на линеен модел с помощта на Limma [41] беше проведено за подбор на диференциално експресирани гени между условията.

Количествена RT-PCR в реално време

Статистика

Данните, получени чрез извършване на qPCR, бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA с помощта на софтуера SPSS Версия 22 (IBM, Armonk, NY, USA) и са представени като средно ± стандартно отклонение. Когато беше установена статистическа значимост за ANOVA, беше използван post hoc тестът на Student-Newman-Keuls за определяне на разликите между леченията.

Резултати

454 пиросеквенция и монтаж

транскриптомен

Характеристики на 454-пиросеквениращи четения и уникални последователности за S. aurata транскриптоми на черния дроб и скелетните мускули. а Разпределение на честотата на идентични 454-пиросеквениращи отчитания на проби от черен дроб и скелетни мускули. б Разпределение на средна дължина на сглобените уникални последователности на транскриптомите на черния дроб и скелетните мускули

Анотация и генна онтология

Класификация на функционалната генна онтология на S. aurata черен дроб, скелетни мускули и хибридни транскриптоми. Четвъртото ниво на GO термини е използвано за биологичен процес (а), третото ниво за молекулярна функция (б) и 4-то ниво за клетъчен компонент (° С)

Класификация по функционална генна онтология на анотациите, присъстващи изключително в черния дроб и скелетните мускули. Четвъртият от GO термините е използван за биологичен процес (а) и 3-то ниво за молекулярна функция (б)

Разпространение на най-засегнатите видове BLAST на генни анотации в хибрида S. aurata транскриптом показа най-високата хомология с NCBI нередудентни последователности от бази данни от Stegastes partitus (23,5%), последвано от Larimichthys crocea (16,3%), Neolamprologus brichardi (7,5%), Sparus aurata (3,6%), Takifugu rubripes (3,5%), Cynoglossus semilaevis (3,5%) и Kryptolebias marmoratus (3,4%) (фиг. 4).

BLAST най-засегнати видове разпределение на хомоложни последователности на анотации в S. aurata хибриден транскриптом

Анализ на микрочипове и генна експресия

С цел идентифициране на нови биомаркери, свързани с OXPHOS, представляващи интерес за хранителни изследвания в S. aurata, ние използвахме получените транскриптомични данни за проектиране на олигонуклеотиден микрочип, за да анализираме допълнително промените в генната експресия поради продължително гладуване или диети за хранене, различаващи се в състава на макроелементите. За тази цел три групи риби са хранени 23 дни на диети HLL (високо протеини, ниско съдържание на липиди, ниско съдържание на въглехидрати; със състав на макроелементи, подобен на диетата на дивите S. aurata), MHL (Среден протеин, Високи липиди, Ниско съдържание на въглехидрати; със състав, подобен на търговските диети за S. aurata култура) и LLH (ниско съдържание на протеини, ниско съдържание на липиди, високо съдържание на въглехидрати; с частично заместване на протеина с въглехидрати в сравнение с диетата с HLL). Четвърта група риби са лишени от храна за същия период. Ефективността на растежа на изгладнели риби и диети, хранени с риба, HLL, MHL и LLH, изразени като среден SGR (%/ден) ± SD, е -0,89 a ± 0,54, 2,54 c ± 0,21, 2,07 bc ± 0,33 и 1,43 b ± 0,51, съответно (различните горни букви показват значителни разлики, стр Фиг. 5

За потвърждаване на данните от микрочипове, нивата на иРНК на няколко гена, участващи в OXPHOS, бяха определени чрез RT-qPCR в проби от черен дроб и скелетни мускули от S. aurata подложени на дългосрочно гладуване или хранени диети, различаващи се по състав на макроелементи. Анализира се изобилието на тРНК от осми гени, участващи в митохондриалната електронно-трансферна верига (NDUFB8, NDUFS1, COQ10, UQCR11A, COX5B1 и COX6A2), синтеза на ATP (ATP5B) и ADP/ATP транслокация (SLC25A6). Нивата на иРНК на NDUFB8 и NDUFS1, компоненти на NADH: убихинон оксидоредуктаза, не са били засегнати от хранителното състояние на черния дроб и скелетните мускули. (Фиг. 6а и б). Експресията на COQ10, протеин, необходим за активността на коензим Q в електронната транспортна верига [42], също се определя в тъканни проби на третирани риби. В черния дроб COQ10 иРНК значително се увеличава след гладуване, достигайки стойности 17 пъти по-високи от рибите, хранени с диета HLL, и 9,3 и 10,2 пъти по-високи от рибите, хранени с диети LLH и MHL, съответно. Различно регулиране на експресията на COQ10 се наблюдава в скелетната мускулатура от хранителните условия: установено е значително 3-кратно намаление при изгладнелите риби в сравнение с тези, хранени с високо протеинова/нисковъглехидратна диета (HLL) (Фиг. 6в).

Изобилието на иРНК на UQCR11A и COX5B1, компоненти на убихинол-цитохром с редуктаза и цитохром с оксидаза, съответно, на дихателната верига, показва подобно поведение в резултат на гладуване или хранене на различни диети. Гладуването значително повишава експресията на двата протеина в черния дроб (UQCR11A: 1,8 и 1,9 пъти в сравнение с рибите, хранени съответно с HLL и MHL; и COX5B1: 3,2 до 4,5 пъти в сравнение с хранените риби, независимо от диетата) и скелетните мускули (1,8 до 2,0 пъти за UQCR11A и 2,4 до 9,2 пъти за COX5B1 в сравнение с хранените риби, независимо от диетата). Диетичният състав не повлиява експресията на UQCR11A, докато нивата на иРНК на COX5B1 значително се увеличават 2,9 и 3,9 пъти в скелетните мускули на рибите, хранени с диета LLH, в сравнение с тези, хранени съответно с HLL и MHL (Фиг. 6г и д).

Друг компонент на цитохром с оксидазата, COX6A2, също е силно повлиян от липсата на храна в черния дроб. Гладуването значително повишава чернодробните нива на иРНК на COX6A2 23,1 до 34,6 пъти, в зависимост от диетата. За разлика от това, експресията на COX6A2 не се влияе от хранителното състояние в скелетната мускулатура (фиг. 6е). Нито гладът, нито съставът на диетата значително повлияват експресията на ATP5B, субединица на каталитичното ядро ​​на F1F0-ATP синтаза, в скелетната мускулатура (фиг. 6g). SLC25A6, известен също като ADP/ATP транслоказа 3, е член на семейството на разтворените носители 25, което улеснява обмена на ADP и ATP през вътрешната мембрана на митохондриите чрез механизъм за антипортиране [43]. В черния дроб гладът значително е увеличил 14,3 до 19,3 пъти експресията на SLC25A6 в сравнение с хранените риби. Ефектът от гладуването зависи от състава на диетата в скелетните мускули: диета, хранена с риба HLL, представя по-ниските нива на mRNA на SLC25A6, които са съответно 7,6 и 8,2 пъти по-високи при рибите, хранени с диета MHL и рибите с глад (фиг. 6h).

Дискусия

Транскриптомен анализ

Анализ на подобие на BLAST на уникални последователности в S. aurata хибриден транскриптом срещу NCBI не-излишна база данни показва по-висока хомология на гени от десет вида риби, принадлежащи към Percomorphaceae подразделение (68,3% от анотациите), както е в случая S. aurata [47]. Малкият брой анотации, съвпадащи с последователности от S. aurata подчертава ограничената геномна информация, налична за този вид в базата данни на NCBI.

Хранително регулиране на OXPHOS в S. aurata

За разлика от чувствителността на експресията на OXPHOS гени в черния дроб на дългосрочно гладуващите S. aurata, диетичният състав не е причинил значителни промени в модела на експресия на OXPHOS гените. Независимо от това, експресията на OXPHOS гени в скелетната мускулатура е по-засегната от хранителния състав на макронутриентите. В сравнение с рибите, хранени с HLL, предлагането на диета с ниско съдържание на протеини/високо въглехидрати (LLH) насърчава тенденцията за повишаване на нивата на mRNA на повечето гени, чиято експресия значително се увеличава в скелетните мускули на изгладнели риби, като COX5B1. Като се има предвид, че съставът на макронутриентите на LLH е далеч от диетичния състав на дивата природа S. aurata и доведоха до най-ниските стойности на SGR сред хранени риби, нашите констатации са в съответствие с факта, че частичното заместване на хранителния протеин с въглехидрати намалява наддаването на тегло и води до нива на експресия на пептидите, регулиращи апетита, близки до стойностите, наблюдавани при глад S. aurata [67].

Заключения

Четиристотин петдесет и четири секвениране на проби от черен дроб и скелетни мускули от дългосрочно гладуващи S. aurata непълнолетни и диети, хранени с риба, различаващи се по състав на макроелементи, ни позволиха да получим транскриптом с дълбоко покритие. По-нататък транскриптомните данни са използвани за конструиране на олигонуклеотиден микрочип, за да се анализира ефекта от глада и състава на диетата върху експресията на OXPHOS компоненти. Нашите открития подкрепят схващането, че дългосрочното гладуване подобрява цитохром с оксидазата и OXPHOS в черния дроб на S. aurata. Сред диференциално експресираните гени COQ10, COX6A2 и SLC25A6 в черния дроб и COX5B1 в черния дроб и скелетната мускулатура са забележително чувствителни към промените в хранителния статус и могат да бъдат полезни за проследяване на въздействието на промените в режима на хранене и състава на диетата в риба.