Документи

Публикация на 16 март 2017

микробни

Препис на аноксигенни фототрофни бактерии от микробни съобщества на термалния извор Горячинск (Байкал.

ISSN 00262617, Микробиология, 2014, кн. 83, № 4, стр. 407421. Плеядис Паблишинг, ООД, 2014. Оригинален руски текст А.М. Калашников, В.А. Гайсин, М.В. Сухачева, Б. Б. Намсараев, А.Н. Пантелеева, Е.Н. Нуянзина Болдарева, Б. Б. Кузнецов, В.М. Горленко, 2014, публикувано в Микробиология, 2014, кн. 83, № 4, стр. 484499.

Термалните извори привличат вниманието на микробиолозите предимно като местообитания на термофилни микроорганизми, представляващи различни физиологични и таксономични групи. Микробните постелки, разработени в леглата с вдъхновение, с цианобактерии, едноклетъчни водорасли и аноксигенни фототрофни бактерии (APB), действащи като производители, се считат за системи, които най-много приличат на древните фототрофни общности [1]. Температурата на повърхностните термални води постепенно се променя от висока, благоприятна за термофилни микроорганизми, до умерена. По този начин термалните извори представляват естествен модел, позволяващ изследване на преходните състояния между термофилни и мезофилни микробни общности.

Термалните извори могат да бъдат разделени на няколко типа [2], като най-често срещаният тип са алкалните нитротермални води. Провинциите с алкална азотна термална вода обхващат големи територии в Централна Азия, Източен Сибир,

Индия, източна и южна Африка, Южна Америка, Европа, западна част на Съединените щати, както и западните и източните (но не централни) райони на Исландия. Геохимично характеристиките на азотната термална вода се определят от процесите на силикатна хидролиза и загуби на кислород за окисляване; в резултат преобладаващото газообразно съединение е азотът и сулфатите частично се редуцират до хидросулфиди. В Байкалската рифтова зона има голям брой азотни термални извори с температури до 84 и рН, вариращи от 6,1 до 9,3. Те се образуват независимо от магматичните и термометаморфните процеси, което ги прави различни от термалните води в зоните на активен вулканизъм [3].

Микробните съобщества на Байкалските рифтови пръстени отдавна са изследвани; въпреки това, видовият състав на фототрофните общности преди е бил изследван само с конвенционални микробиологични методи, без да се използват молекулярно генетични

Аноксигенни фототрофни бактерии от микробни съобщества на термалния извор Горячинск (район Байкал, Русия)

A. M. Kalashnikova, V. A. Gaisinb, M. V. Sukhachevab, B. B. Namsaraevc, A. N. Panteleevab, E. N. NuyanzinaBoldarevaa, B. B. Kuznetsovb и V. M. Gorlenkoa, 1

a Институт по микробиология на Виноградски, Руска академия на науките, pr. 60летия Октября 7, к. 2, Москва, 117312 Русия

b Център за биоинженерство, Руска академия на науките, Москва, Институт по обща и експериментална биология на Русия, Център за научни изследвания в Бурят, Сибирски клон, Руска академия на науките,

UlanUde, Русия Получава се на 29 ноември 2013 г.

Ключови думи: Горячинск, Байкал, хидротерми, аноксигенни фототрофни бактерии, pufLM, fmoA

1 автор-кореспондент; имейл: [email protected]

МИКРОБИОЛОГИЯ Vol. 83 № 4 2014

КАЛАШНИКОВ и др.

техники. Най-изчерпателно изследвани фототрофни общности са изворите, разположени на полуостров Котелниковски, Болшереченскринг на 30 км от северната граница на резервата Баргузинатура и извор Уро на 40 км от селището Баргузин [4, 5]. Обща хидрохимична и микробиологична характеристика на термалните води на Байкалската рифтова зона е предоставена, например, в [6]. Термалният извор Горячинск е известен повече от 200 години, но неговата микробна общност не е изследвана цялостно.

Целта на настоящата работа беше да се изследва видовото разнообразие на АРВ в микробни рогозки на термалния извор Горячинск, като се използват както конвенционални микробиологични техники, така и молекулярно-генетични методи.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Източници. Бактериите бяха изолирани от алгобактериални рогозки, които се развиха в различни температурни зони на пролетта Горячнск. За да се характеризират местата за вземане на проби, температурата се регистрира с електрически термометър (HANNA HI 8314, Румъния), рН, с преносим рН-метър (HANNA HI 8314) и обща соленост, с TDS4 метър (Сингапур). Концентрациите на сулфид бяха определени с помощта на стандартната колориметрична техника. Образци на матове и микробни култури бяха изследвани чрез светлинна микроскопия с помощта на микроскоп AnOlympus BX41 (Olympus, Япония).

Абсорбционните спектри на клетъчните пигменти се анализират след разрушаване на клетките от пробите и чистите култури, като се използва Soniprep 150 плюс ултразвуков дезинтегратор при 14,5 kHz. Клетъчните остатъци се утаяват чрез центрофугиране при 7000 g в продължение на 5 минути и супернатантата, съдържаща мембранни фрагменти и хлорозоми, се използва за спектрометрия.

Таксономична класификация на кислородните фототрофи се основава на техните морфологични признаци. Аноксигенни фототрофи са регистрирани чрез култивиране в селективни медии. Нишковидни APB (FAPB) се отглеждат в среда, съдържаща следното (g/L): KH2PO4, 0.4; NH4CI, 0.5; MgCl2, 0,4; KCl, 0,5; NaCl, 0,5; Na2S2O3, 0,5; CaCl2 2H2O, 0,3; NaHC03, 0,5; витамин В12, 10 g/L; и разтворът на микроелементите според Pfennig и Lippert.

Основната хранителна среда е модифицирана по няколко начина, за да поддържа растежа на фототрофните бактерии от различни таксономични групи. За термофилни видове Chloroflexus и лилави несвързани бактерии, растежната среда беше допълнена с 0,5 g/L натриев ацетат, 0,5 g/L натриев малат, 0,5 g/L натриев пируват, 0,1 g/L екстракт от мая и 0,1 g/L Na2S 9H2O. Бактериалните видове от семействата Chromatiaceae и Chlorobiaceae се отглеждат в основната среда, допълнена с 0,5 g/L Na2S 9H2O, 0,5 g/L натриев тиосулфат и 0,5 g/L натриев ацетат. Аеробна бак

бактериите, съдържащи териохлорофил, се отглеждат в онагарски плочи с хетеротрофна среда [7].

Видовете APB, растящи в културите, са идентифицирани на базата на клетъчна морфология, бактериохлорофил и каротеноидни типове, способност за автотрофен и хетеротрофен растеж върху сулфида, способност за растеж в тъмнината и въздействието на температурата и рН.

Молекулярно-генетичната идентификация на APB се извършва в чисти култури, като се използва PCR с праймери към групите специфични молекулярни маркери pufLM и fmoA.Изолирани са чисти култури от аеробни бактерии, съдържащи бактериохлорофил а, въз основа на техните 16S рРНК генни последователности.

ДНК беше изолирана от FAPB култури, използвайки метода CTAB [8] с незначителни модификации. От други бактериални култури се изолира ДНК, както е описано по-рано в [9].

Фрагменти от pufLM оперон бяха амплифицирани и последователно използвани с помощта на два специфични за групата набора праймери. Наборът от праймери, специфични за пурпурна сяра и несвързани бактерии, беше описан в [10]. Другата двойка праймери, специфични за съдържащи хлорозоми FAPB, са проектирани за настоящото проучване: напред, 5'CGAGCCGGARTAYAAGATCAA3 'и обратен 5'AGAAGATCGAGAGCATGTG3'. И за двете системи на праймерите, PCR протоколът включва началния цикъл от 2 минути при 94 ° С, 30 секунди при 56 ° С и 90 секунди при 72 ° С, 42 цикъла от 30 секунди при 94 ° С, 30 секунди при 56 ° С, 90 секунди при 72 ° С и финалното удължаване за 5 мин при 72 ° С.

Използвани са и праймерите, конструирани за откриване на pufMgene в Agrobacterium tumifaciens: 5'GCACCTGGACTGGA3 '(напред) и 5'CCATGGTCCAGCGCCAGA3' (обратно). Протоколът PCR беше както следва: първоначална денатурация при 94 ° С за 3 минути, 30 цикъла от 50 s при 94 ° С, 50 s при 55 ° С и 50 s при 72 ° С; окончателно удължение при 72 ° С за 10 минути.

Амплификация на 16S рРНК генни фрагменти и последващо секвениране на PCR продукти бяха извършени с универсални бактериални праймери 27f и 1492r [11].

Амплификация и последващо секвениране на фрагмент от afmoA бяха извършени с праймерите, описани в [12].

PCR сместа (25 L) за амплификация на целеви генни фрагменти съдържа 1 буфер за BioTaqDNA полимераза (17 mM (NH4) 2SO4; 67 mM TrisHCl, рН 8,8; 2 mM MgCl2), 12,5 nmol всеки dNTP, 50 ng ДНК шаблон, 5 pmol от всеки подходящ праймер и 3 U BioTaq ДНК полимераза (Dialat LTD, Русия).

PCR продуктите бяха пречистени с помощта на Wizard SV Geland PCR CleanUp System (Promega, САЩ) в съответствие с инструкциите на производителя и последователността