Присъединителен център за екологичен и еволюционен синтез (CEES), Департамент по биологични науки, Университет в Осло, Осло, Норвегия

припокриване

Сдружение Норвежки институт за изследване на природата, Sluppen, Трондхайм, Норвегия

Отделение за зоологически науки, Университет Адис Абеба, Адис Абеба, Етиопия

Природонаучен музей на асоциацията, Университет в Осло, Осло, Норвегия

Принадлежности Норвежки институт за изследване на природата, Слупен, Трондхайм, Норвегия, Природонаучен музей, Университет в Осло, Осло, Норвегия

Афилиационен център за екологичен и еволюционен синтез (CEES), Департамент по биологични науки, Университет в Осло, Осло, Норвегия, Природонаучен музей, Университет в Осло, Осло, Норвегия

Природонаучен музей на асоциацията, Университет в Осло, Осло, Норвегия

Природонаучен музей на асоциацията, Университет в Осло, Осло, Норвегия

Природонаучен музей на асоциацията, Университет в Осло, Осло, Норвегия

Отделение за растителна биология и управление на биологичното разнообразие, Университет Адис Абеба, Адис Абеба, Етиопия

Природонаучен музей на асоциацията, Университет в Осло, Осло, Норвегия

Присъединителен център за екологичен и еволюционен синтез (CEES), Департамент по биологични науки, Университет в Осло, Осло, Норвегия

Природонаучен музей на филиалите, Университет в Осло, Осло, Норвегия, Институт Алфред Вегенер, Център за изследвания на полярните и морските среди на Хелмхолц, Периглациални изследвания, Потсдам, Германия

  • Берихун Гебремедхин,
  • Ойщайн Флагстад,
  • Afework Bekele,
  • Десален Чала,
  • Vegar Bakkestuen,
  • Sanne Boessenkool,
  • Магнус Поп,
  • Галина Гусарова,
  • Аудун Шрьодер-Нилсен,
  • Силеши Немомиса

Фигури

Резюме

Цитат: Gebremedhin B, Flagstad Ø, Bekele A, Chala D, Bakkestuen V, Boessenkool S, et al. (2016) ДНК метабаркодирането разкрива диетично припокриване между застрашената Walia Ibex и домашните кози - последици за опазването. PLoS ONE 11 (7): e0159133. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159133

Редактор: Марко Аполонио, Университет в Сасари, ИТАЛИЯ

Получено: 4 ноември 2015 г .; Прието: 28 юни 2016 г .; Публикувано: 14 юли 2016 г.

Наличност на данни: Данните за последователността, свързани с тази публикация, са депозирани в Цифровото хранилище на Dryad: http://doi.org/ doi: 10.5061/dryad.45kf5. Тези данни включват: fasta файл на таксономичната справочна библиотека версия 2.0; филтрираните последователности на диетичните продукти с тяхната таксономична идентичност, както се извежда от програмата ecoTag.

Финансиране: Лабораторните анализи са финансирани от Изследователския съвет на Норвегия [http://www.forskningsradet.no], грант №. 191627/V40 към CB, Център за екология и еволюционен синтез (CEES, [http://www.mn.uio.no/cees/]) в Университета в Осло, Фондация за опазване на видовете Mohamed Bin Zyad [http: //www.speciesconservation.org], ID на проекта. 11052467 и Норвежката програма за развитие, изследвания и висше образование (NUFU, [http://siu.no/eng/Programme-information/Development-cooperation/NUFU]; проект 2007/10058 за SN и CB). Теренната работа и събирането на проби са финансирани от Conservation des Espèces et des Populations Animals [http://www.cepa-association.org], CEPA. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Показани са местата за събиране на отделните проби (жълти кръгове: Walia ibex; сини квадрати: домашна коза). Прекъснатата линия показва основния ареал на местообитанията на козела Walia.

През последните години ДНК метабаркодирането, подход, който комбинира PCR амплификация на стандартизиран, кратък маркер за идентификация на видовете с технология за секвениране от следващо поколение, се прилага като нов инструмент в диетичните изследвания [24], като и двете използват съдържанието на червата [25, 26 ] и фекални проби [25]. ДНК метабаркодирането се оказа полезно за малки и средни бозайници [25, 27–30], както и за по-големи тревопасни животни [31, 32]. В това проучване изследвахме диетата на козела Walia, живеещ в националния парк Симен планина, използвайки метабаркодиране на ДНК за идентифициране на хранителни растения от фекалиите и го сравнихме с данните, получени за домашната коза. Таксономичното разпределение на ДНК последователностите, извлечени от фекалиите, беше постигнато с помощта на нова, разширена версия на курирана афро-алпийска таксономична справочна библиотека (версия 2.0, виж [33] за версия 1.0), изградена чрез секвениране на ДНК от таксономично проверени образци на повечето афро- алпийски растителни видове (таблица S1). По-конкретно, ние оценихме припокриването на диетата между двата тревопасни вида и оценихме резултатите в контекста на опазване.

Методи

Област на изследване и събиране на проби

За нашата колекция от фекални проби, ние се фокусирахме върху основния ареал на местообитанията на Walia ibex (Фигура 1). Видът обитава райони в близост до ръба на ескарпа, което ги предпазва от хищници и човешки смущения [14]. Вземането на проби беше ограничено до райони, често използвани от видовете и споделяни с домашни кози, и ние събирахме проби от различни групи, търсещи храна по планинските ескарпи, приблизително на 2 км една от друга. Проследихме групи животни и изчакахме да се преместят, за да не ги безпокоим. Местата за търсене бяха проверени за изпражнения скоро след преместването на животните на други места и пробите бяха държани във флакони със силикагел до пристигането им в лабораторията. Пробите бяха събрани през сухия сезон между март и май 2011 г. и бяха записани местоположенията на пробите и местообитанието им (фиг. 1). За да сведем до минимум вероятността за множество проби от един и същи индивид, събрахме само по една фекална проба от всяка срещана група на козирози. Фекалии от кози са събрани от сърфиращи лица, открити по време на теренното проучване и/или от близките населени места, където е потвърдено, че козите преглеждат в близост до местообитанията на козела Walia.

Декларация за етика

Нашето изследване беше неинвазивно и не включваше никакво залавяне или обезпокояване на животни. Събрахме само проби от растения и фекалии за анализи на метабаркодиране. Достъпът до защитената зона е бил с разрешение от Етиопския орган за опазване на дивата природа (EWCA), държавна институция, която отговаря за управлението и опазването на защитените зони и дивата природа и използването на трофеи и продукти от дивата природа в Етиопия.

Генетични анализи на фекални проби

Извличането на ДНК от 48 фекални проби от предполагаемия произход на Walia ibex и домашни кози е извършено в Природонаучния музей на Университета в Осло в специална лаборатория за анализи на ДНК от проби с ниско съдържание на ДНК. Приблизително 20 mg от вътрешната част на изсушените фекални пелети бяха използвани при всяка екстракция, извършена съгласно протокола, описан в [25]. Екстракционните заготовки бяха включени във всеки екстракционен кръг, за да се следи възможно замърсяване.

За да проверим идентичността на тревопасните животни, ние амплифицирахме и секвенирахме 700 bp фрагмент от цитохром b (Cyt-b) гена, както е описано в Pedrosa et al. [38]. В случаите, когато усилването на този фрагмент не работи, ние усилвахме по-кратък фрагмент от 426 bp [39]. PCR реакциите се провеждат в 25 μl обема, съдържащи 1,25 U Platinum ® Taq ДНК полимераза с висока точност (Invitrogen), 1x PCR буфер, 2 mM MgSO4, 1 mM dNTPs, 0,4 mM от всеки праймер, 0,8 mg/ml говежди серумен албумин (BSA) и 2,5 μl ДНК екстракт. Продуктите от PCR бяха секвенирани на ABI 3730 секвенсор и бяха проведени диетични анализи за пробите, идентифицирани като целеви видове от BLAST търсения в GenBank (n = 23 за Walia ibex; n = 16 за домашна коза).

Филтрирането на последователностите и таксономичното заключение на молекулярни оперативни таксономични единици (MOTUs, виж [41]) бяха извършени с помощта на пакета OBITools [42]. Филтрирането беше извършено както в [43], с допълнителна стъпка за почистване с помощта на програмата obiclean (част от пакета OBITools, вижте [44]). Първоначалната таксономична анотация е извършена с програмата ecoTag, като се използва както местна таксономична справочна библиотека, обхващаща афро-алпийската флора, включително флората на ареала на ареала на Walia ibex (афро-алпийската справочна библиотека версия 2.0; S1 Таблица; депозирана в Dryad Digital Repository http://doi.org/doi:10.5061/dryad.45kf5) и справочна библиотека, базирана на EMBL стандартни последователности, издание 113. Последното е създадено чрез in silico PCR с програмата ecoPCR [45] на EMBL стандартни последователности (освобождаване 113) с trnL-g и trnL-h праймери (разрешени са пет несъответствия между праймера и целевата последователност). Филтрираните последователности на диетичните артикули с тяхната таксономична идентичност, както се извежда от програмата ecoTag, се депозират в Цифровото хранилище на Дриада: http://doi.org/doi:10.5061/dryad.45kf5. За всички анализи използвахме изчислителните съоръжения, предоставени от Норвежкия метацентър за изчислителна наука (Notur).

За развитието на афро-алпийската таксономична справочна библиотека версия 2.0 (таблица S1), афро-алпийската справочна библиотека версия 1.0 [33] беше допълнена от допълнителни таксони, събрани в ареала на местообитанията на целевите видове в планината Симен (особено от по-ниски коти). Ваучери за всички видове съдови растения бяха събрани на местата, където се срещаха групи от Walia ibex. Освен това бяха поправени няколко малки грешки в резултат на печатарски грешки и едно погрешно идентифициране в предишната версия на референтната библиотека (вж. Таблица S1). Всички нови ваучери бяха идентифицирани и депозирани в Националния хербариум, Университета в Адис Абеба (AAU). Последователността на този допълнителен референтен материал беше извършена, както е описано в [33]. Новата версия на библиотеката съдържа последователности от веригата P6, получени от общо 664 екземпляра, представляващи 58 семейства, 172 рода и 332 вида (някои екземпляри са идентифицирани само от род; вижте таблица S1 за пълен списък на таксоните). Използвайки тази библиотека, 100% от таксоните могат да бъдат идентифицирани като семейство, 66,7% от род и 29,8% от видове.

За диетичния анализ се запазваха последователности, ако те присъстваха с поне 10 четения във всяка проба и ако минималната им най-добра идентичност беше> 0,98 на таксон в една от двете референтни библиотеки, като приоритет се дава на курираната афро-алпийска библиотека (Таблица S1). Автоматизираните таксономични анотации бяха усъвършенствани въз основа на познанията за конкретната подгрупа таксони, за които е известно, че се срещат в планината Симен, като се използва флората на Етиопия и Еритрея и флората на планината Симен [46–51]. Последователностите, които бяха идентифицирани за един и същ таксон, бяха комбинирани в една молекулярна оперативна таксономична единица (MOTU) и бяха определени общите номера на последователностите на таксон във всяка фекална проба. Също така, категорията фураж е създадена за всеки MOTU, като се прави разлика между храсти/дървета, растения и граминоиди.

Анализ на данни

По-нататък анализирахме припокриване на диетите, използвайки опростения индекс на Morisita (или Morisita-Horn) [57]. Изчисленията са извършени 1) за пълния набор от данни, 2) за 10-те най-предпочитани диетични артикула за всеки от целевите видове (общо 15 MOTUs) и 3) за четирите най-предпочитани MOTU, споделени между Walia ibex и домашна коза. Тъй като промяната в растителността по отношение на надморската височина е значителна и не са взети проби от кози от височини над 4000 m, ние извършихме допълнителни изчисления, като взехме предвид само пробите от Walia ibex, събрани от височини, сравними с тези на пробите от кози (16 проби).

Резултати

Идентифицирахме ДНК на Walia ibex в 23 проби от фекалии и ДНК от кози в домашни условия в 16 проби. ДНК на овце и клипспрингер е идентифицирана съответно в шест и една проба. Една проба беше замърсена с човешка ДНК, а последната проба не успя да се амплифицира. Секвенирането доведе до 321 745 четения на последователности след филтриране, от които 43,6% (140 437) идват от проби Walia ibex и 56,4% (181 308) от проби кози. Общо бяха идентифицирани 54 уникални растителни MOTU и бяха приписани на видове (22), род (25) или по-високи таксономични нива (31) (таблица S2). Фекалните проби от Walia ibex и домашната коза дават съответно 45 и 44 растителни MOTU. Диетата на Walia ibex се състоеше от разклонения (35,9%), дървета и храсти (63,7%) и граминоиди (треви или подобни на трева растения; 0,4%). Тези пропорции бяха сходни при козата; Съответно 42,5%, 57,0% и 0,5%.

Във всяка фекална проба броят на MOTU варира от 4 до 28. Кривите на разреждане за всяка отделна проба достигат насищане във всички случаи (S1 Фиг.), Категорично показващи, че дълбочината на секвениране е достатъчна за извличане на пълната информация от PCR продуктите, получени от отделни екстракти от ДНК. Кривите на разреждане за MOTU, получени от всеки от двата целеви вида, показват, че броят на MOTU не достига насищане за Walia ibex (фиг. 2а), което може да означава, че богатството на диетата на Walia ibex може да се увеличи, ако повече проби бяха добавени към анализа. За разлика от това, въпреки че размерът на пробата е по-малък за домашната коза, кривата на разреждане изглежда близо до насищането (Фигура 2b).