• Тази статия е актуализирана
  • Поправката към тази статия е публикувана в Journal of Animal Science and Biotechnology 2019 10: 71

Резюме

Заден план

Това проучване изследва валидността на теста, базиран на ДНК-маркер, за да се определи чувствителността към диария ETEC-F4 чрез сравняване на резултатите от две техники за секвениране на ДНК при прасета свине след експериментална инфекция с F4 ентеротоксигенни Ешерихия коли (ETEC-F4). Ефектите от диетата и генетичната чувствителност бяха оценени чрез измерване на честотата на диария след отбиване на прасенца (PWD), фекални Е. coli проливането и индекса на диария.

Резултати

Тест, базиран на ДНК маркер, насочен към гена муцин 4 (MUC4), който кодира прасета, идентифицирани с F4 на fimbria, или като напълно чувствителни (SS), частично или леко податливи (SR) и устойчиви (RR) към развитие на ETEC-F4 диария. За по-нататъшен анализ на това беше предприето ДНК секвениране и беше наблюдаван значително по-висок дял на С нуклеотиди за RR и SR при XbaРазцепвам генотипове на сайтове в сравнение със SS. Не е установена обаче съществена разлика между SR и RR генотипите. Следователно резултатите, получени от секвенирането на Sanger, ретроспективно разпределят прасетата в устойчив генотип (MUC4–), в случай на С нуклеотид и възприемчив генотип (MUC4+), в случай на G нуклеотид, на мястото на единичния нуклеотиден полиморфизъм. Общо 72 прасета прасенца (възраст

21 дни), с тегло 6,1 ± 1,2 kg (средно ± SEM), са хранени с 3 различни диети: (i) група с положителен контрол (PC), допълнена с 3 g/kg цинков оксид (ZnO), (ii) отрицателна контрола (NC) група (без ZnO или HAMSA) и (iii) диета, съдържаща 50 g/kg високоамилозен царевичен скорбялен продукт (HAMSA), естерифициран с ацетат. На пет и шести дни след отбиването всички прасета бяха заразени орално с ETEC (серотип O149: F4; токсини LT1, ST1, ST2 и EAST). Процентът на свинете, които са развили диария след инфекция, е по-висок (P = 0,05) в MUC4+ прасета в сравнение с MUC4– прасета (съответно 50% срещу 26,8%). Освен това прасетата, хранени с ZnO, са имали по-малко ETEC-F4 диария (P = 0,009) от прасетата, хранени с други диети, но отделянето на ETEC от фекалиите е подобно (P > 0,05) между диетите.

Заключение

Тези резултати потвърждават това MUC4+ прасетата имат по-голямо разпространение на ETEC-F4 диария след излагане и че прасетата, хранени с ZnO, независимо от MUC4 статус, са намалили ETEC-F4 диария. Освен това, секвениране или количествено определяне на разпределението на единичен нуклеотиден полиморфизъм при XbaМястото на разцепване може да бъде по-надеждно при идентифициране на генотипна чувствителност в сравнение с традиционните методи.

Заден план

Това проучване включва три хипотези. Първо, ние предположихме, че анализ на последователността, за да се определи наличието на G или C нуклеотиди в XbaI полиморфният сайт е валиден метод за определяне на потенциалната чувствителност към ETEC-F4. След като направихме това, ние предположихме, че прасетата с F4 рецептор (MUC4+ алел) ще развие повече ETEC-F4 диария, отколкото прасета без F4 рецептора (MUC4– алел) при експериментално заразяване с ETEC-F4. Накрая разсъдихме, че храненето с диета, допълнена с ацетилирано царевично нишесте с високо амилоза (HAMSA) или цинков оксид (ZnO), ще намали честотата на диария, свързана с ETEC-F4, при отбити прасета, експериментално заразени с ETEC-F4.

Методи

Този експеримент е одобрен от Комитета по етика на животните от университета Мърдок (R2812/16).

Животни, жилища, експериментален дизайн и диети

Това проучване използва проби, взети като част от друго проучване [16], което изследва влиянието на различни диети, хранени след отбиване, върху диария, кръв и производствени променливи. Съответно, само данни, отнасящи се до връзките между податливостта или устойчивостта на свинете, оценени от наличието или отсъствието на MUC4 мутация, по отношение на хранените диети беше изследвана.

На 21-дневна възраст 72 мъжки кастратни прасета (Голяма бяла × Landrace) с тегло 6,1 ± 1,2 kg (средно ± SEM) са отбити от търговска свинарница в Западна Австралия. Прасетата пристигнаха в университета Мърдок на две партиди с интервал от три дни, като всички прасета бяха обект на същия експериментален срок. При пристигането на прасетата бяха разпределени на случаен принцип в тяхната експериментална група за третиране в шест повторни кошари (четири прасета на кошара), като се използва рандомизирано разпределение на блока въз основа на живото тегло при отбиването (три обработки × шест повторения на лечение × четири прасета на кошара; н = 72). Свинете бяха настанени в три различни помещения при температура 28,0 ± 1,0 °C в кошари от метална конструкция с пластмасови подове, позволяващи най-малко 0,6 m 2 на прасе. Всяка стая имаше по две писалки на процедури, като общо имаше шест писалки. Писалките бяха снабдени с нипелна поилка, пет космически хранилки и пластмасови бутилки за обогатяване.

Проучването представлява факториална подредба на леченията с фактори, които са (а) генетичната чувствителност към развитие на диария, свързана с ETEC-F4 (MUC4+/ -) и (b) три диети: (i) положителна контрола (PC), която включва основната диета с добавени 3 g ZnO/kg (ii) отрицателна контрола (NC), която се състои от основната диета без ZnO или HAMSA и (iii) основната диета с 50 g HAMSA/kg, заместваща 50 g/kg пшеница. Основната диета е формулирана така, че да отговаря на изискванията на животните съгласно Националния съвет за изследвания (NRC, 2012). Диетичните състави и анализираното брутно енергийно и хранително съдържание са представени в Таблица 1. Диетите, заедно с водата, се предлагат ad libitum за 3 седмици след отбиването.

Анализ на фуражите

Диетичните проби бяха анализирани за сухо вещество, брутна енергия, суров протеин, сурови фибри, калций, фосфор, неутрални детергентни влакна, киселинни детергентни влакна, нишесте и цинк съгласно протоколите за InVivo Labs (Виетнам). Съдържанието на сухо вещество се определя с помощта на метод EC 152/2009. Съдържанието на N се определя чрез използване на метод на горене 2001.11 [17] и съдържанието на суров протеин се изчислява като съдържание на N × 6,25. Съдържанието на ADF и NDF се определя чрез използване на методите ANKOM Technology 8 и 9 съответно [18]. Брутното енергийно съдържание се определя с помощта на балистичен калориметър (SANYO Gallenkamp, ​​Loughborough, UK). Съдържанието на цинк се определя с помощта на атомно-абсорбционна спектроскопия (AAS11 152/2009/EEC).

Събиране на ДНК проба

Четините и прикрепените фоликули бяха събрани от всички 72 прасета в деня на отбиването. Това беше направено чрез внимателно ограничаване на прасенцата, саниране на областта зад ухото с помощта на 70% етанолови кърпички, издърпване на 10–20 четина, включително фоликула, и поставяне на пробата в стерилни епруветки върху лед. Приборите и ръкавиците се почистват между всяка проба, за да се гарантира, че не е настъпило кръстосано замърсяване на фоликуларните клетки.

ДНК екстракция и тест, базиран на маркер

ДНК беше извлечена от фоликулите с помощта на DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Австралия) съгласно инструкциите на производителя. Концентрацията на ДНК се измерва с помощта на спектрофотометър Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Масачузетс, САЩ). За да се определи отсъствие или присъствие на MUC4 алел, анализът на полиморфизъм на дължина на фрагмента на полимеразна верижна реакция (PCR-RFLP) е завършен върху 25 ng геномна ДНК в общ обем 25 μL, като се използва 5 μL MyTaq Red Reaction буфер, 0,5 единици MyTaq HS ДНК полимераза (Bioline, Нов Южен Уелс, Австралия) и 0,4 μmol/L от всеки MUC4 грунд: 5′-GTCCCTTGGGTGAGAGGTTA/5′-CACTCTGCCGTTCTCTTTCC (Sigma-Aldrich, Австралия). Термоциклирането се извършва, както е описано от Jensen et al. [5]. Рестрикционният ензим се смила с XbaI (Promega, Wisconsin, USA) за идентифициране на полиморфизъм върху 5 μL PCR продукт е завършен за една нощ при 37 ° C и след това се използва на 2% агарозен гел с GelRed (Biotium, Калифорния, САЩ) с помощта на 100 bp генна линийка (Thermo Fisher Scientific, Масачузетс, САЩ) чрез електрофореза за 120 минути при 80 V. Лентите се визуализират на BioRad GelDoc (Life Science, Калифорния, САЩ) с устойчиви алели, разглеждани като единична лента при 367 bp и чувствителни алели, разглеждани като две ленти при 151 и 216 bp.

Анализ на ДНК последователност на MUC4

ETEC-F4 модел на инфекция

На пет и шести дни след отбиването прасетата бяха заразени с ентеротоксиген Е. coli щам (ETEC; серотип O149: F4; токсини LT1, ST1, ST2 и EAST). Накратко, аликвотна част от запас ETEC-F4, съхранявана при - 80 ° C, беше отгледана върху триптичен соев агар (TSA) с 5% овча кръв (Thermo Scientific, Австралия) за една нощ при 37 °В. Избрана е единична колония с ясна хемолиза и е добавена към 20 ml стерилен триптичен соев бульон (TSB) (Bacto Tryptic соев бульон; Becton, Dickinson and Company, САЩ) и се инкубира във водна баня през нощта в 23 часа °В. Културата се центрофугира при 2000 хж за 15 минути супернатантата се изхвърля и пелетите се суспендират отново в 20 ml прясна TSB. От тази суспензия 4 ml бяха добавени към 400 ml TSB и допълнително инкубирани в продължение на 3,5 часа при 37 °С с орбитално разклащане при 120 r/min. Културата се центрофугира при 2000 ×ж за 15 минути супернатантата се изхвърля и пелетите се суспендират отново в прясно студено TSB. Взета е аликвотна част за измерване на концентрацията на жизнеспособни бактерии. Културата се държи на лед и всички прасенца се дозират орално с 9 ml 1.03 × 10 9 единици, образуващи колонии (CFU/ml) на пет и шести дни след отбиването. Устната сонда се извършва чрез задържане на прасенцето и прилагане на инокулата чрез пистолет за напояване.

Резултат за консистенция на фекалиите, ETEC-F4 диария и фекално β-хемолитично ETEC отделяне

Консистенцията на фекалиите се оценява визуално за всяко прасенце всеки ден в продължение на 21 дни от проучването, като се използва четиристепенна скала, както следва: резултат (1) твърд, (2) мек, леко се разпространява, (3) мек и хлабав, (4) водниста течна консистенция. Установено е, че прасетата с резултат 4 между шестия и четиринадесетия ден имат ETEC-F4 диария. В нулеви, пет, шести, седем и девет дни след отбиването се вземат ректални тампони с фекалии, за да се определи отделянето на β-хемолитичен ETEC-F4. Тези тампони бяха поставени върху TSA 5% плочи от агарен кръвен агар (Thermo Scientific, Thebarton, Австралия), инкубирани една нощ при 37 °C и визуално оценена и сравнена с ETEC-F4, използван при инфекцията, на следващия ден за наличие на β-хемолитични колонии. Плочите се състоят от 5 секции и имат оценки от 0 до 5, където 0 няма растеж, а 5 е възможно най-високият растеж [19]. Общият резултат от отделянето на ETEC на фекалиите се изчислява като сумата от всички резултати от тампонната плоча от нулевия, петия, шестия, седмия и деветия ден.

Статистика

Резултати

MUC4 анализ

Тестване на ДНК за XbaПолимофизмът I, използвайки метода PCR-RFLP, показа, че от 72 тествани прасета, 51 е установено, че са напълно чувствителни или частично чувствителни (SS/SR). Разпределението на тези свине е 16 в PC, 18 в NC и 17 прасета в HAMSA-хранени лечения. За по-нататъшен анализ на генотипа на всяко прасе, резултатите, получени чрез секвениране на Sanger и NGS, бяха сравнени с метода PCR-RFLP. Последователността на Sanger имаше способността да идентифицира C или G невцеолтид в MUC4 място, докато NGS може да идентифицира дела на C към G нуклеотиди, присъстващи на същото място. Резултатите потвърдиха, че прасетата с C нуклеотид чрез секвенция на Sanger също имат над 50% C нуклеотиди чрез NGS в MUC4 сайт и поради това бяха класифицирани като устойчиви. Използвайки непроменлив анализ, значителна асоциация (P 0,05) е намерен между SR и RR генотипове (Фиг. 1). Следователно прасетата бяха разпределени ретроспективно в устойчиви (MUC4–), в случай на С нуклеотид и чувствителен (MUC4+), в случай на G нуклеотид, при MUC4 ген (фиг. 1). От тестваните 72 прасета, общо 16 прасета бяха MUC4+ и разпределени в лечения като 5, 4 и 7 за прасета, хранени с диети PC, NC и HAMSA, съответно.

ефект

Графиката показва съотношението на шансовете и 95% CI от трите генотипа. Пунктираната вертикална линия показва коефициент на съотношение 1 (без ефект). Данните бяха анализирани с помощта на еднопроменлив модел, за да се определи дали има връзка между процента на C до G нуклеотиди, определен от NGS и генотипа, определен от PCR-RFLP теста

Едно MUC4+ прасенце хранени PC диета и a MUC4– прасенце, хранено с диетата HAMSA, умира по време на експеримента поради тежък нехемолитичен Е. coli илеит и едно прасенце (MUC4+ хранени с PC диета) е отстранен поради куцота. Данните за тези прасета бяха премахнати от набора от данни.

ETEC-F4 диария и отделяне на фекални β-хемолитични ETEC

Общо 8,8% от прасетата, хранени с PC диета, 50% от свинете, хранени с NC диета, и 34,8% от прасетата, хранени с диетата HAMSA, развиха диария ETEC-F4. Наблюдава се значителна разлика в диарията (P = 0,048) между PC и NC диети; обаче няма разлика (P > 0,05) е отбелязано между прасета, хранени с диети HAMSA и PC, или прасета, хранени с диети HAMSA и NC. Прасета, които бяха класифицирани като MUC4+ имали по-висок процент диария (P = 0,05) в сравнение с MUC4– прасета (съответно 50% и 26,8%). Използвайки универсалния модел, вероятността от развитие на ETEC-F4 диария е силно свързана (P Фиг. 2

Прогнозирана вероятност за процента на C/G нуклеотиди, присъстващи в XbaI полиморфизъм и способността да се предсказва ETEC-F4 диария. Данните бяха анализирани с помощта на едномерния модел

Прасета, хранени с диетичен компютър, имат по-нисък индекс на диария (DI) в сравнение с NC и HAMSA групите (1.97 срещу 14.2 и 14.3, P = 0,02). Прасета, хранени с HAMSA, са имали DI, не по-различен от NC групата (P > 0,05). Като цяло, генетично резистентните прасета са имали DI от 6,2, а чувствителните прасета са имали резултат 14,2 (P = 0,05), както е определено чрез последователността на Sanger. Въпреки че не са значителни поради малкия брой податливи свине и високото стандартно отклонение, податливите прасета, хранени с PC, имат по-нисък DI в сравнение с NC и HAMSA групите (съответно 2,78 срещу 19,4 и 20,4). Взаимодействието между DI, лечения и генотип не може да бъде анализирано поради ненормално разпределение на данните.

Диетичното лечение не повлиява общите резултати за отделяне на β-хемолитични ETEC, като средният общ резултат на отделяне на ETEC за диети PC, NC и HAMSA е съответно 3,96, 4,05 и 4,42 (P = 0.94). Генотипът не е повлиял на проливането на ETEC (P = 0,43) и не се наблюдава значителна връзка (P = 0,38) между отделянето на ETEC и някоя от групите за диетично лечение и MUC4 +/MUC4– генотипове.

Дискусия

Генетично податливи прасета (MUC4+) се очаква да възпроизведе повече F4 Е. coli в тънките черва в сравнение с MUC4– прасета, водещи до по-големи Е. coli проливане [26]. В резултат на това тези свине са по-податливи на инфекция поради по-високата колонизация [26] и фекално-оралното рециклиране в сравнение с техните отрицателни аналози. В настоящото проучване общото отделяне на ETEC от фекалиите не е значително по-високо при чувствителни прасета в сравнение с резистентни прасета. Casini et al. [21] показа, че на четири и пет дни след заразяване с ETEC-F4, податливите прасета имат значително по-голямо отделяне на фекалии и повече диария в сравнение с резистентните прасета. Това се подкрепя допълнително от друго проучване, където средните фекални резултати, дни с диария и общо Е. coli проливането бяха по-високи (P

Заключение

Този експеримент потвърди, че ETEC-F4 диарията е значително по-висока през MUC4+ прасета, както се определя чрез последователен анализ на гена в сравнение с MUC4– прасета след експериментална ETEC инфекция. Освен това прасетата, хранени с ZnO, са имали по-малко диария от прасетата, хранени с други диети, но това не е отразено в промяна във фекалиите Е. coli проливане между диетите. В допълнение, секвениране или количествено определяне на разпределението на единичен нуклеотиден полиморфизъм при XbaМястото на разцепване може да бъде по-надеждно при идентифициране на генотипна чувствителност в сравнение с традиционните методи. Необходими са обаче допълнителни изследвания, за да се увеличи степента на заразяване и проливането на ETEC MUC4+ свине чрез определяне на други участващи фактори и/или промяна на метода на доставка на ETEC-F4, за да се осигури точна доза. Освен това разбирането на генетиката на чувствителността към ETEC също е от търговско значение за намаляване на въздействието на болестта в производството.

Наличност на данни и материали

Авторите могат да предоставят набора от данни, използван и анализиран при поискване.