Молекулярна и структурна ендокринология

Редактиран от
Деби К. Търмънд

Катедра по молекулярна и клетъчна ендокринология, Изследователски институт Бекман, град Хоуп, САЩ

Прегледан от
Джонатан Боган

Йейлски университет, САЩ

Амира Клип

Институт за изследване на болни деца, Канада

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

snare

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Хенри Уелкъм Лаборатория по клетъчна биология, Колеж по медицински, ветеринарни и биологични науки, Институт по молекулярна клетъчна и системна биология, Университет в Глазгоу, Глазгоу, Великобритания
  • 2 Колеж по медицински, ветеринарни и биологични науки, Институт за сърдечно-съдови и медицински науки, Университет в Глазгоу, Глазгоу, Великобритания

SNARE протеините са неразделна част от вътреклетъчния везикуларен трафик, което от своя страна е процесът, в основата на регулираната експресия на субстратни транспортери като глюкозния транспортер GLUT4 на клетъчната повърхност на инсулиновите целеви тъкани. Нарушеният инсулин стимулиран трафик на GLUT4 е свързан с намалена сърдечна функция в много болестни състояния, най-вече диабет. Въпреки това, нашето разбиране за експресията и регулацията на SNARE протеините в сърдечната тъкан и как те могат да се променят при диабет е ограничено. Тук ние характеризираме масива от SNARE протеини, експресирани в сърдечната тъкан, и количествено определяме нивата на експресия на VAMP2, SNAP23 и Syntaxin4 - ключови протеини, участващи в стимулираната от инсулин транслокация на GLUT4. Изследвахме нивата на SNARE протеин в сърдечната тъкан от два модела на инсулинова резистентност на гризачи, db/db мишки и мишки, хранени с високо съдържание на мазнини, и показват промени в моделите на изразяване са очевидни. Такива промени могат да имат последици за сърдечната функция.

Въведение

Ефективното регулиране на метаболизма е от съществено значение при всички видове клетки, за да се гарантира, че са изпълнени изискванията за генериране на АТФ. Това е особено важно в силно енергийните органи като сърцето, където контрактилното действие на кардиомиоцитите трябва непрекъснато да се подхранва, за да се поддържа изпомпването на приблизително 5 литра кръв, богата на хранителни вещества, в и около системната циркулация всяка минута. Също така е жизненоважно сърцето да проявява метаболитна гъвкавост, за да адаптира своето съкратително производство в отговор на повишените нужди, например по време на тренировка. Нормалният сърдечен метаболизъм се характеризира с преобладаващо използване на мастни киселини като метаболитен субстрат, с относително по-ниско използване на глюкозата (1). Това е логично, тъй като мазнините са по-обилен и богат на енергия източник на гориво, което го прави идеален за сценарии, при които се изискват устойчиви умерени нива на АТФ. Въпреки това, няколко състояния на сърдечни заболявания са частично дефинирани (и потенциално причинени) от дефицити в усвояването и метаболизма на глюкозата.

Отдавна е установено, че сърдечно-съдовите заболявания са водеща причина за смъртност сред диабетната популация, отчасти поради високата честота на съдови заболявания, които се появяват поради трайно прекомерно количество глюкоза (и мазнини) в кръвния поток (4). Съществува обаче и директен патологичен ефект на диабета върху сърдечната функция, характеризиращ се с първоначална диастолна дисфункция преди структурно ремоделиране и прогресия до сърдечна недостатъчност, наречена диабетна кардиомиопатия (5-7). Съществуват сериозни доказателства, че метаболитните нарушения, като вътремиоцелуларното натрупване на липиди в сърцето и свързаната сърдечна инсулинова резистентност, могат да бъдат критични ранни фактори за прогресията на това състояние (8–10). Най-забележителното е, че при миши модел на диабетна кардиомиопатия свръхекспресията на инсулиночувствителния глюкозен транспортер GLUT4 възстановява анормалната сърдечна метаболитна и контрактилна функция до стойностите, наблюдавани в контролите (11, 12). Освен това е доказано, че инсулиновата резистентност/гликемичният контрол е от прогностично значение при пациенти след миокарден инфаркт при хора (13–15), като експериментален модел на плъхове, идентифициращ началото на сърдечна (несистемна) инсулинова резистентност, се корелира с неблагоприятни възстановяване/ремоделиране (16).

Установено е, че общи концепции, получени от други инсулиночувствителни клетъчни типове, са приложими за сърцето, например, че GLUT4 е функционално преобладаващият транспортер на глюкоза (17). При базални условия по-голямата част от GLUT4 не се намира на клетъчната повърхност, а по-скоро се разпределя между общия ендозомен път за рециклиране и депо от специализирани везикули за съхранение на GLUT4 (GSV), които могат бързо да бъдат мобилизирани към клетъчната повърхност в отговор на активирането на инсулина рецептор (18). Както сортирането на GLUT4 през различни вътреклетъчни отделения, така и сливането на GSV с плазмената мембрана (PM) изисква действието на специфични SNARE протеини (19). В скелетната мускулатура и мастната тъкан SNARE протеините, които регулират сливането на GSV с PM, са VAMP2, SNAP23 и Syntaxin 4, докато Syntaxin 6 и 16 медиират секвестирането на GLUT4 в пуловете на GSV в мрежата на транс Golgi (20-25).

Участието на SNARE в множество стъпки от трафика на GLUT4 ги прави интригуваща потенциална цел в контекста на болестта. Има много теории, свързани с инсулиновата резистентност, като например инхибиране на проксималната инсулинова сигнализация чрез липидно медиирано активиране на протеин киназа С (35, 36) или променено освобождаване на адипоцитокини от разширена и възпалена мастна тъкан (37, 38). Съществуват обаче и доказателства от модели на гризачи, корелиращи променена експресия на SNARE протеин (Syntaxin4, Syntaxin6, VAMP2, VAMP3, SNAP23, Munc18) със скелетна мускулатура и мастна инсулинова резистентност (31, 32, 39–41). Освен това при пациенти с диабет тип 2 засилената експресия на синтаксин 8 в мастната тъкан е свързана значително с намалена експресия на GLUT4 и нарушен толеранс към цялото тяло на глюкозата (42). Въпреки че от тези проучвания не става ясно дали промените в нивата на SNARE протеин са причинно-следствени или адаптивни промени, първоначалните проучвания от 2 независими инсулиноустойчиви модела показват, че насочването към SNARE протеини може да бъде жизнеспособна стратегия за възстановяване на стимулирания от инсулин трафик на GLUT4 и подобряване на метаболитните резултати (43 –45).

Следователно, целта на тази работа е да характеризира експресията на широк спектър от изоформи SNARE в първичната сърдечна тъкан за възрастни. Освен това беше оценено дали експресията на тези протеини (в допълнение към GLUT4) е променена при 2 различни модела на мишки с диабет. Това проучване е първата стъпка към разкриване на ролята на различни SNAREs в стимулирания от инсулин трафик на сърдечен GLUT4 и е от клинично значение поради връзката на инсулиновата резистентност на сърцето с диабетната кардиомиопатия и миокардния инфаркт. SNARE също са важни както при неинсулиново стимулиран (напр., Чрез контракция) трафик на GLUT4, така и при трафик на транспортера на мастни киселини CD36 (46). Следователно тази работа е ценна и основополагаща в контекста на регулирането на сърдечния метаболизъм като цяло.

Резултати и дискусия

Количествено определяне на VAMP2, Syntaxin 4 и SNAP23 в сърдечните лизати

В адипоцитите и мускулите SNARE протеините, свързани със сливането на GSV-PM, са VAMP2, Syntaxin 4 и SNAP23 (26, 27, 30). Първо се опитахме да определим количествено експресията на тези SNARE в сърдечни лизати на гризачи. Рекомбинантните SNARE протеини бяха експресирани и пречистени от бактерии и използвани като стандарти за количествено имуноблотинг за сравнение със сигнала, получен от сърдечни проби на мишки. Пример за този технически подход е показан на Фигура 1 за количествено определяне на експресията на Синтаксин 4, с количествено определяне на всички 3 SNAREs, отчетени в Таблица 1. Сравнителни стойности, показани за адипоцитите на 3T3-L1, са получени от преди публикувана работа, използвайки подобен подход (48) . Тази техника се провежда и с обединен лизат, генериран от сърдечна тъкан, получен от 3 отделни сърца на плъхове. Получените средни стойности съвпадат с тези на пробите на мишки (1,45 × 10 12 копия на mg SNAP23; 6,82 × 10 11 копия на mg Sx4; 3,05 × 10 11 копия на mg VAMP2).

Фигура 1. Количествено определяне на експресията на Синтаксин 4 в сърцето. Протеиновите лизати се генерират от 20-седмична сърдечна тъкан на мъжка мишка и се подлагат на SDS-PAGE и имуноблотинг заедно с пречистен рекомбинантен Sx4. Лизатите се инкубират с антитела, сондиращи експресията на Syntaxin 4 и GAPDH (контрол на натоварването), както е показано. Зареденият с протеин се отнася до 10 или 20 μg протеин за пробите от кардиомиоцити на мишки M1-M3 или 0,5–1,5 ng от пречистен протеин Syntaxin 4 (липсва трансмембранният домейн и по този начин мигрира по-бързо от ендогенния, пълен размер Syntaxin4), както е посочено. M1-3 показва биологично независими сърдечни проби на мишки, където всяка проба е съставена от лизат, генериран от 2 до 3 отделни сърца. Посочени са приблизителните позиции на маркерите за молекулно тегло. Границите показват къде са изрязани изображения само с цел представяне. Показани са данни от представителен имуноблот, количествено изразени в таблица 1.

маса 1. Количествено определяне на експресията на протеин SNARE в първичната сърдечна тъкан на мишката.

SNARE изразяване в модели на диабетна мишка

В рамките на това проучване сърдечните сегменти от 6 db/db и контрол (db/m) мишките бяха лизирани и изследвани за експресията на широк спектър от SNARE протеини и GLUT4 чрез имуноблотинг. Типичен набор от данни е показан на фигура 2. В съответствие с предходния анализ на експресията на сърдечен протеин от този модел на диабетна мишка (53, 54), е установено, че експресията на GLUT4 е значително (P Ключови думи: диабет, кардиомиопатия, SNARE протеини, инсулинова резистентност, GLUT4

Цитиране: Bowman PRT, Smith GL и Gould GW (2019) Cardiac SNARE Expression in Health and Disease. Отпред. Ендокринол. 10: 881. doi: 10.3389/fendo.2019.00881

Получено: 25 септември 2019 г .; Приет: 03 декември 2019 г .;
Публикувано: 19 декември 2019 г.

Деби К. Търмънд, Изследователски институт Бекман, САЩ

Амира Клип, Изследователски институт за болни деца, Канада
Джонатан Боган, Йейлски университет, САЩ

† Настоящ адрес: Peter R. T. Bowman and Gwyn W. Gould, Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, Глазгоу, Великобритания