Редактирано от Ajay Chawla, Калифорнийски университет, Сан Франциско, Калифорния, и прието от редакционната колегия на 15 септември 2014 г. (получено за преглед на 24 декември 2013 г.)

Значимост

Нарастването на свързаните със затлъстяването заболявания доведе до засилени усилия за идентифициране на нови терапевтични цели. Натрупването на липиди при затлъстяване предизвиква нискостепенно възпаление, което свързва затлъстяването със свързаните с него заболявания, особено инсулиновата резистентност и диабет тип 2. В този доклад проучихме група вродени В-лимфоцити във висцерална бяла мастна тъкан (ДДС) на мишки, които (i) са способни да произвеждат противовъзпалителния медиатор IL-10; (ii) попълнени от прекурсорни клетки в далака по време на диета, индуцирано затлъстяване (DIO); и (iii) нарушен в ДДС на DIO мишки, което води до намалена защита срещу свързана със затлъстяването инсулинова резистентност, която може да бъде подобрена чрез добавяне на тези клетки. Тези констатации идентифицират снабдени с далак вродени B клетки в ДДС като неидентифицирани досега терапевтични цели за заболявания, свързани със затлъстяването.

Резюме

Няколко скорошни проучвания са в съответствие със защитната роля на В-клетките, произвеждащи IL-10, произвеждани от далака, при индуцирано от затлъстяването възпаление и инсулинова резистентност. Премахването на далака при диети, предизвикани от затлъстяване (DIO), мишки изостри възпалението на ДДС, което може да бъде подобрено чрез добавяне на IL-10 (27). Нефракционираните В клетки на DIO мишки и на пациенти с T2D произвеждат намалени нива на IL-10 в отговор на in vitro стимулация (10, 28). Докато тези открития предполагат критична роля на далака за осигуряване на IL-10, вероятно чрез продуциране на IL-10 В клетки, за защита срещу свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност, клетъчните механизми на действие остават неясни.

Тук показваме, че значителен брой В клетки с повърхностен фенотип, наподобяващ вродени B-1a и регулаторни B10 B клетки (12, 16, 29), но различни от наскоро идентифицирани „мастни естествени регулаторни B клетки“ (19), попълват ДДС при стационарни условия. Подобно на техните аналози в далака и PerC, тези клетки в ДДС спонтанно произвеждат IgM антитела и представляват по-голямата част от IL-10-компетентните В клетки на това анатомично място. Докато далакът поддържа набор от вродени B клетки в ДДС, търсенето на тези клетки в разширяващия се ДДС по време на DIO изпреварва набирането им и затлъстялата среда в ДДС допълнително нарушава тяхната компетентност IL-10. Следователно, спленектомията се обостря, докато добавянето с тези вродени В-клетки чрез адоптивен трансфер подобрява, индуцираната от DIO системна инсулинова резистентност. Като цяло, нашите констатации идентифицират неразпозната по-рано подгрупа от IL-10-компетентни вродени B клетки в ДДС и предостави доказателства за критичната роля на далака при доставката на тези клетки на ДДС за защита срещу свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност.

Резултати

Значителен брой B клетки с повърхностен фенотип, наподобяващ вродени B-1a и B10 B клетки, попълват ДДС и са компетентни в производството на IL-10.

Характеризиране на вродени B клетки в ДДС. Използвани са мишки В6 на възраст 10-15 седмици на RCD. (A – E) Клетките бяха анализирани за разпространението и броя на вродените В-клетки чрез поточна цитометрия. Показани са представителни графики или обобщение на резултатите от три независими експеримента (n = 10–15 на група). (F) Клетките бяха или прясно анализирани, или култивирани в отсъствие или присъствие на РМА, йономицин и LPS (PIL) в продължение на 5 часа и анализирани за вътреклетъчен IL-10 чрез поточна цитометрия. Показани са представителни графики от два независими експеримента (n = 8–10 на група). (G) FACS-сортирани B-клетъчни подгрупи се култивират в отсъствие или присъствие на LPS в продължение на 40 часа. IL-10, секретиран по време на култивиране, беше изследван чрез ELISPOT анализ. Показани са представителни снимки от два независими експеримента (n = 5 на група). (Н) Прясно изолираните клетки се характеризират за вътреклетъчно ниво на IgM чрез поточна цитометрия. Показани са представителни графики от три независими експеримента (n = 10–12 на група). (I) FACS-сортирани B-клетъчни подгрупи се култивират в продължение на 16 часа. IgM, секретиран по време на култивиране, беше изследван чрез ELISPOT анализ. Показани са представителни снимки от два независими експеримента (n = 5 на група). ISO, контрол на изотипа.

Заедно горните резултати показват, че ДДС съдържа значителен дял от вродени В-клетки, които спонтанно произвеждат IgM. Много от тези клетки също са способни да произвеждат IL-10 при стимулация.

DIO прогресивно влошава броя и компетентността на IL-10 на вродени B клетки в ДДС и PerC.

Заедно горните резултати показват, че DIO прогресивно намалява броя и компетентността на IL-10 на вродени B клетки в ДДС и PerC.

Слезката поддържа набор от вродени B клетки в ДДС и PerC по време на DIO.

Тези констатации показват, че далакът реагира на излишните липидни диети и разширява вродени В-клетки и по този начин служи като източник за набирането на тези клетки към ДДС. Нашето наблюдение, че индуцирано от DIO намаление на CD5 + В клетките се случва по-рано при ДДС от PerC, заедно с констатацията ни, че отстраняването на далака ускорява индуцираното от DIO намаление на CD5 + B клетките в PerC, е в съответствие с предложената роля на далака за подпомагане пул от вродени B клетки в PerC, които могат да бъдат наети към разширяващия се ДДС. Заедно с нашите по-ранни наблюдения, че DIO постепенно води до намаляване на вродените В клетки в ДДС с течение на времето, тези данни предполагат, че търсенето на вродени B клетки в нарастващия ДДС по време на затлъстяването изпреварва набирането им от далак и PerC. Затлъстялата среда допълнително уврежда компетентността на IL-10 на тези клетки и може да компрометира оцеляването на вродени B клетки в ДДС.

Спленектомията изостря DIO-асоциираната инсулинова резистентност.

Компетентните за IL-10 CD5 + В клетки могат да бъдат ex vivo разширени от наивни В клетки на далака при условия, благоприятстващи диференциацията на В10 клетки (34, 35). Тези ex vivo разширени CD5 + B клетки са защитни при миши модел на множествена склероза, хронично възпалително заболяване на централната нервна система (35). Тъй като по-ранните ни проучвания показват, че намаляването на CD5 + В клетките в ДДС на DIO мишки се дължи предимно на недостатъчно предлагане, нашите окончателни експерименти оценяват терапевтичния потенциал на този ex vivo подход. В нашите експериментални условия, ex vivo разширени CD5 + B клетки, но не CD5 - B клетки увеличават вътреклетъчния IL-10 след стимулация с PIL (Фиг. S7). След това FACS сортира CD5 + B клетки и CD5 - B клетки и ги прехвърли в PerC на DIO мишки, следвайки нашия протокол, използван за първични CD5 + B клетки (Фиг. S6B). Подобно на резултатите за първичните В клетки, трансферът на ex vivo разширени В клетки не повлиява наддаването на телесно тегло или разширяването на ДДС (Фиг. 5G), но подобрява чувствителността към инсулин при DIO мишки (Фиг. 5 Н и I).

Колективно тези открития показват критична роля на производството на IL-10 за защитните ефекти на вродени В-клетки в DIO-асоциирана инсулинова резистентност.

Дискусия

В заключение, нашите проучвания са идентифицирали група от снабдени с далак вродени B клетки в ДДС като неразпознати досега играчи в ограничаването на антагонизиращата инсулин среда по време на затлъстяване. Следователно, нашите открития посочват тези клетки като нови цели за терапевтична интервенция при свързано със затлъстяването възпаление и инсулинова резистентност.

Материали и методи

Мишки и диети.

Реактиви.

Използвахме флуоресцентно маркирани антитела, закупени от BD Biosciences или eBioscience. Те включват антитела срещу миши TCR-β, CD90, CD19, B220, CD5, CD43, CD21, CD23, CD1d, CD11b, CD11c, CD45.1, CD45.2, F4/80, IgM, IgD, Ly-6C, IA b, Ly-6G, PanNK, NK1.1, IL-10, CD45, GM-CSF, Ki-67 и подходящи изотипни контроли за повърхностно и вътреклетъчно маркиране. Разтвори за оцветяване на жизнеспособността 7-амино-актиномицин D (7AAD) и пропидиев йодид (PI) са от eBioscience. PMA, йономицин, LPS, DNase I и колагеназа тип IV са получени от Sigma-Aldrich. Колагеназа тип I е от Worthington Biochemical Corp. Реагентите за клетъчна култура са от Invitrogen Life Technologies или Mediatech. Други реагенти са описани по-долу във всеки специфичен анализ.

Подготовка на клетки.

Анализирахме клетки, пречистени от перигонадни мастни накладки, PerC измиване, далак, черен дроб, бял дроб и периферна кръв едновременно във всяка мишка. Пречистването на SVF от ДДС, IHL от черен дроб и SPL от далак се извършва, както е описано по-рано (46). SLC суспензии се приготвят чрез смилане на смляна белодробна тъкан с 1 mg/ml колагеназа IV и 10 единици/ml DNase I, разтворени в RPMI среда 1640 при 37 ° С за 1 h, последвано от промиване за отстраняване на ензимите. PerC се промива с PBS, съдържащ 5% (обем/обем) FBS (Life Technologies) за събиране на клетки PerC. Периферната кръв се събира чрез сърдечна пункция с EDTA като антикоагулант. Левкоцитите от периферна кръв (PBL) се приготвят чрез градиентно центрофугиране, използвайки Ficoll-Paque (GE Healthcare Life Sciences). Червените кръвни клетки бяха лизирани с помощта на ACK буфер (Lonza).

Анализи на повърхностно и вътреклетъчно маркиране и поточна цитометрия.

Изолиране на B-клетъчни подмножества и тестове за стимулиране.

Спленектомия и фалшива операция.

Направихме спленектомия и фиктивни операции, както е описано (36). Накратко, мишки на възраст 4-5 седмици са претърпели операцията под упойка. Коремът на мишката беше отворен и далакът беше изложен. Кръвоносните съдове се каутеризират и далакът се отстранява внимателно. За фалшива операция коремът беше отворен, но далакът не беше отстранен. Коремът беше затворен чрез зашиване първо на мускулния слой, а след това на кожния слой. Мишките бяха оставени да се възстановят за 1 седмица в автоклавирани клетки с автоклавирана храна и вода преди всякакви по-нататъшни манипулации.

Ex Vivo разширяване на CD5 + B клетки.

Ние ex vivo разширихме CD5 + и CD5 - В клетки, както е описано (34, 35). Мъжките мишки В6 на RCD бяха използвани за пречистване на CD19 + В клетки на далака чрез положителна селекция, както е описано по-горе. Общо В-клетките на далака се култивират върху сливащ се слой на γ-лъчево облъчени захранващи клетки, експресиращи CD40-лиганд (CD40L) и BAFF (40LB клетки) в присъствието на миши рекомбинантен IL-4 (eBioscience) в продължение на 4 дни и се рекултивират на нов подавач клетки за още 4 дни в присъствието на миши рекомбинантен IL-21 (eBioscience). След това клетките се анализират чрез повърхностно и вътреклетъчно маркиране, последвано от поточна цитометрия. Алтернативно, клетките бяха маркирани на повърхността и FACS сортирани в CD5 + и CD5 - B клетки, използвайки BD FACSAria клетъчен сортиращ.

Приемащ трансфер на В клетки.

За да проследим прехвърлените клетки, използвахме донорски клетки от CD45.1 + мишки, хранени с RCD. Подготвихме положително подбрани CD19 + В клетки от PerC промивка и ги инжектирахме i.p. в CD45.2 + мишки, хранени с HFD, и анализирали получателите 3 седмици по-късно. За трансфер на първични CD5 + В клетки, ние събрахме донорски клетки от PerC и далак на WT B6 или IL-10-дефицитни мишки. Положително избраните CD19 + В-клетки на далака или PerC клетки бяха маркирани на повърхността и FACS сортирани, измити с PBS и инжектирани i.p. в реципиентни мишки, хранени с HFD. Сортираните по FACS CD5 + и CD5 - В клетки, разширени ex vivo, бяха прехвърлени по подобен начин.

Лечение на IgM.

Закупихме нормална миши IgM цяла молекула от Rockland Immunochemicals. Антитялото се диализира срещу PBS, филтрира се за стерилизация и i.p. инжектирани в мишки с HFD в доза от 0,4 mg на мишка седмично в продължение на 8 седмици.

Клетъчни култури и измервания на цитокини.

Ние култивирахме SVF с получени от PerC CD19 + В клетки и изследвахме секрецията на цитокини. Накратко, ние подготвихме SVFs, както е описано по-горе, от DIO мишки, хранени с HFD за 12 седмици. SVF клетките се пречистват допълнително чрез градиентно центрофугиране, като се използва Percoll от GE Healthcare (46). CD19 + В клетки бяха избрани положително от PerC измиване на В6 мишки, хранени с RCD, както е описано по-горе. SVF и В клетките се култивират при различни съотношения в U-дънни 96-ямкови плаки при 37 ° C в овлажнен инкубатор за клетъчна култура с 5% CO2 при отсъствие или присъствие на LPS (1 μg/mL) за различна продължителност. Супернатантът се събира в края на културата и се съхранява при -80 ° С. Цитокините в супернатанта са анализирани с помощта на BD Cytometric Bead Array Mouse Th1/Th2/Th17 Kit citokine kit (BD Biosciences) следвайки протокола на производителя.

Анализ на метаболитни параметри.

Метаболитните параметри бяха изследвани, както е описано по-горе (46). Телесното тегло е измерено между 9:00 и 10:00 AM. Направихме IPITT и IPGTT на мишки, които бяха хранени с HFD за 10–12 седмици. За IPITT мишките бяха на гладно в продължение на 6 часа, изследвани за кръвна глюкоза чрез вземане на проби от сафенозна вена, получиха i.p. инжектиране на Novolin R (Novo Nordisk) при 2 единици на килограм телесно тегло, последвано от допълнително вземане на проби от глюкоза на 15, 30, 60 и 120 минути. За IPGTT, мишките са гладували в продължение на 16 часа и са изследвани за кръвна глюкоза, както е описано за IPITT, като се използва i.p. инжектиране на глюкоза при 1 g на килограм телесно тегло. Постихме мишки в продължение на 16 часа и изследвахме нивото на кръвен инсулин, както беше описано по-рано (46). Мишките бяха убити в гладно без измерване на телесно и органно тегло.

Количествена PCR в реално време.

По време на убийството ДДС беше бързо замразен в течен азот и съхраняван при -80 ° C. Измерихме нивата на тРНК на TNF-α, адипонектин и IL-10, както е описано (46). Използвахме публикуваните преди това последователности от праймери за измерване на IL-17A транскрипти на иРНК (47). PCR в реално време се извършва с помощта на SYBR зелено в инструмент MyiQ2 (Bio-Rad), както е описано (46).

Статистически анализи.

Данните са представени като средни стойности ± SEM. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на несдвоен двустранен t тест след изследване на нормалността на разпределението на данните. Стойност P 1, до която може да бъде адресирана кореспонденция. Имейл: luc.van.kaervanderbilt.edu или lan.wuvanderbilt.edu .

набор