Ън Джу Шин

1 Традиционен център за изследване на храните, Корейски институт за изследване на храните, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Република Корея

А-рам Хан

1 Традиционен център за изследване на храните, Корейски институт за изследване на храните, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Република Корея

Myung-hee Lee

1 Традиционен център за изследване на храните, Корейски институт за изследване на храните, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Република Корея

Young-Ran Song

1 Традиционен център за изследване на храните, Корейски институт за изследване на храните, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Република Корея

Куанг Мин Лий

1 Традиционен център за изследване на храните, Корейски институт за изследване на храните, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Република Корея

Тае-Гю Нам

1 Традиционен център за изследване на храните, Корейски институт за изследване на храните, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Република Корея

Pomjoo Lee

2 RAFIQ Cosmetics Co., Ltd., 14, Toegye-ro 48-gil, Jung-gu, Сеул, Република Корея

Сун-Йънг Лий

3 Департамент по земеделски биотехнологии, Национален университет в Сеул, Сеул, 08826 Република Корея

Тае-Гю Лим

1 Традиционен център за изследване на храните, Корейски институт за изследване на храните, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365 Република Корея

Резюме

Противокожно възпалителните дейности на екстрактите от розови листенца са описани в предишното ни проучване. Тъй като възпалението на кожата е тясно свързано със стареенето на кожата, нашето проучване изследва ефектите на венчелистчетата на Rosa gallica върху свързаните със стареенето на кожата дейности като избелване на кожата и свойства против бръчки. Всяка проба се приготвя чрез екстракция, като се използват различни съотношения на етанол с цел оценка на оптимални условия на екстракция за промишлено приложение. Воден 50% (обем/обем) EtOH екстракт от венчелистче на R. gallica значително потиска активността на тирозиназата, производството на меланин и индуцираната от слънцето UV-матрица металопротеиназа-1, отличителен белег на образуването на бръчки. В допълнение, водният 50% (v/v) EtOH екстракт показва най-висок антиоксидантен ефект и има най-високо съдържание на флавоноиди, в съответствие с докладваните ефекти против стареене. Като цяло нашите открития показват, че екстрактите от венчелистчета на R. gallica проявяват анти-стареещи ефекти. Освен това, по-специално 50% екстракция на EtOH е оптимална за най-високите анти-стареещи и антиоксидативни ефекти, както и за получаване на най-високо съдържание на флавоноиди.

Въведение

Кожата играе жизненоважна роля като защитна бариера срещу вредни фактори, свързани с наследствеността и генетиката, екологичните проблеми, хормоналните промени и метаболитните процеси (Mukherjee et al., 2006). Сред тях факторите на околната среда, като излагането на слънчева ултравиолетова (UV) радиация, действат като ключови медиатори, които допринасят за преждевременното стареене (Laga and Murphy, 2009). Основните симптоми на стареенето на кожата, което се появява в резултат на фотостареенето, включват дълбоки бръчки, необичайна пигментация и еластичност (Farage et al., 2013; Wlaschek et al., 2001).

Пигментацията е симптом на стареене, което се причинява от необичайно производство на меланин, което води до различни кожни нарушения, включително лунички, мелазма, старчески петна и други хиперпигментационни синдроми (D'Mello et al., 2016; Seo et al., 2003). По пътя на меланогенезата тирозиназата е важна като ензими, ограничаващи скоростта, които преобразуват l-тирозин в l -DOPA и окисляват l-DOPA, за да образуват DOPA-хинон (Akhtar et al., 2015). Следователно инхибирането на тирозиназата е силно свързано със синтеза на меланин. Освен това образуването на бръчки, причинено от загубата на колагенови фибрили и еластаза, е друга характеристика на фотостареенето. Матричната металопротеиназа-1 (MMP-1), секретирана от фибробластите на човешката кожа, е отговорна главно за разграждането на колагена по време на процеса на фотостареене (Pandel et al., 2013). Понижаването на експресията на MMP-1, което инхибира разграждането на колагена, може да подобри функциите за подобряване на бръчките.

Поради гореизложените причини, употребата на инхибитори на тирозиназа или MMP инхибитори се счита за обещаваща стратегия за облекчаване на фотостареенето на кожата. Предишни проучвания показват, че ретинол, екстракт от чесън (кофеинова киселина и S-съюзник цистеин) и фитоцерамид, койева киселина, арбутин и витамин С могат да действат като инхибитори на стареенето на кожата (Couteau and Coiffard, 2016; Kim et al., 2013) . Използването на това вещество обаче включва определени ограничения като различни странични ефекти, включително цитотоксичност, мирис и оцветяване (Yamakoshi et al., 2003). Следователно, настоящите проучвания са фокусирани върху разработването на по-безопасни, естествено получени компоненти, които осигуряват ефективна фотозащита на кожата.

Видовете Rosa, отглеждани по целия свят, се считат за добър източник на хранителни добавки. Съобщава се, че екстрактът от розови листенца (RPE), който съдържа елементи като фенолна киселина, флавоноли и антоцианини, показва много полезни ефекти, като противовъзпалителни действия, в допълнение към други биологични роли (Bitis et al., 2017; Lee et al., 2018; Masek et al., 2017; Navarro-Gonzalez et al., 2015). Тъй като е известно, че тези свойства на RPE са свързани със стареенето на кожата, той е предложен като потенциален кандидат за защита на кожата. Въпреки това, малко се знае за ефекта на RPE върху стареенето на кожата. Освен това водата и етанолът се считат за най-добрите екстракционни разтворители поради разликите в полярността и безопасността при употреба (Abarca-Vargas et al., 2016). По този начин, проби с различни съотношения на вода и етанол (0, 10, 30, 50, 70, 90 и 100% етанол RPE) бяха приготвени чрез екстракция.

Целта на това проучване е да изследва ефекта на RPE върху избелването на кожата и подобряването на бръчките. RPE екстракти с различни съотношения на екстракционен разтворител (0, 10, 30, 50, 70, 90 и 100% разтворители етанол/вода) бяха тествани, за да се определи оптималното съотношение на разтворител за екстракция.

Материали и методи

Реактив

Венчелистчетата на Rosa gallica са внесени от Турция чрез GN Bio (Gyeonggi, Корея). Модифицираната от Dulbecco среда на Eagle’s (DMEM), фетален говежди серум (FBS), пеницилин-стрептомицин-неомицин и 0,5% трипсин-EDTA са закупени от GIBCO ® Invitrogen (Auckland, NZ, USA). Специфични антитела срещу тирозиназа и β-актин са закупени от Santa Cruz Biotech (Санта Круз, Калифорния, САЩ). Първичното антитяло на MMP-1 е получено от R&D системи ™. Всички други химикали, включително алфа-меланоцитостимулиращ хормон (α-MSH), гъбена тирозиназа и l-DOPA (l -3,4-дихидроксифенилаланин) са закупени от Sigma-Aldrich Co., LLC (Сейнт Луис, Мисури, САЩ ).

приготвяне на пробата

Розовите листенца се смесват със 100 ml 0, 10, 30, 50, 70, 90 и 100% (v/v) EtOH (абсолютен етанол). След това разтворимите компоненти се екстрахират във вода от 80 ° С с помощта на кондензатор с обратен хладник. Екстрактът беше филтриран през филтърна хартия номер 2 (Whatman, Maidstone, Англия), концентриран във вакуум и впоследствие разтворен в дестилирана вода и лиофилизиран, за да се използва като проби за теста за функционален анализ.

Клетъчна култура

Меланомните клетки B16F10 са закупени от Korean Cell Line Bank (Сеул, Корея). Клетки от човешки дермален фибробласт (HDF) са получени от д-р Джин Хо Чунг (Медицински колеж, Национален университет в Сеул, Сеул, Корея). И двете клетки се култивират в DMEM, допълнена с 10% фетален говежди серум (v/v) и 1% (v/v) пеницилин при 37 ° C и 5% CO2 условия.

Жизнеспособност на клетките

Клетъчната жизнеспособност беше измерена чрез MTS [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сулфофенил) -2Н-тетразолий] анализ. Клетките се засяват в 96-ямкови плаки и се отглеждат до сливане. След това клетките се гладуват с DMEM без серум за една нощ и се обработват с пробите при посочени концентрации в продължение на 24 часа. След излагане на пробите, 20 μL разтвор на MTS се оставя да реагира с клетките за 1 h. Абсорбцията е измерена с помощта на четец за микроплаки (Sunrise-Basic Tecan, Tecan Austria GmbH Grödig, Австрия) при 570 nm.

In vitro гъбична тирозиназна активност

Анализът на in vitro тирозиназа се провежда съгласно методи, описани по-рано (Kim et al., 2015). Накратко, 40 µL от всяка проба се добавят към буфера за анализ (20 µL 0,1 М калиев фосфат), последвано от инкубация в продължение на 30 минути с 20 µL гъбена тирозиназа (0,02 mg/ml). След това към всяка смес се добавят 40 ul субстрат (1 -DOPA). Реакцията се оставя да протече при стайна температура в продължение на 15 минути, преди образуването на допахром се анализира чрез измерване на абсорбцията при 475 nm с помощта на четец за микроплаки (Infinite ® 2000 PRO, Tecan, Швейцария).

Оценка на производството на меланин

Анализът за производство на меланин се извършва съгласно описания по-рано протокол (Friedmann and Gilchrest, 1987; Gordon et al., 1989). Клетките B16F10 (8 х 10 3 клетки) бяха засяти в 6-ямкови плаки с 2 ml хранителна среда. След 24 часа пробите бяха предварително обработени с клетките за 1 h, след което α-MSH (100 nM) беше изложен на клетките. Клетките се събират след 72 часа и производството на меланин се измерва с помощта на четец за микроплаки (Infinite ® 2000 PRO, Tecan, Швейцария) при 495 nm.

Уестърн петно

Протеинови проби бяха получени от клетки, използвайки 1 × буфер за лизис на клетките (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Концентрацията на протеини е оценена с помощта на Pierce ™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, San José, CA, USA). Протеиновите проби се зареждат в 10% SDS-полиакриламиден гел (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA) за електрофореза и след това се прехвърлят в Immobilon P мембрана (Millipore, Billerica, MA, USA). PVDF мембраната се блокира с 5% обезмаслено мляко за 1 h и мембраната се третира със специфично първично антитяло за една нощ при 4 ° С. Протеиновите ленти бяха открити с помощта на комплект за откриване на хемилуминесценция (GE Healthcare, NJ, САЩ) след хибридизация с конюгирано с HRP вторично антитяло (клетъчно сигнализиране).

Анализ за отстраняване на DPPH радикали

Активността на DPPH за извличане на радикали се измерва, както следва; 0,2 ml всеки екстракт се добавя към 3 ml -етанол, към който се добавят 0,8 ml 400 μM DPPH, разтворен в етанол. Тази смес се завихря за 10 s и се поддържа при стайна температура в продължение на 10 минути и абсорбцията се измерва при 517 nm (Wang et al., 1999). Активността на DPPH за почистване на радикали се изразява като процент от абсорбцията на групата, към която не е добавен DPPH. Всички експерименти бяха повторени минимум 3 пъти.

Общо съдържание на флавоноиди

Общото съдържание на флавоноиди в екстрактите беше измерено по метода на алуминиевия хлорид (Jia et al., 1999), който беше модифициран с помощта на катехин. Към 100 μL от екстракта се добавят 500 μL дестилирана вода и 30 μL NaNO2, след което 6 μL AlCl3 се добавят 6 минути по-късно. След 5 минути се прибавят 200 μL 1 М NaOH и се долива до 1 ml с дестилирана вода. Разтворът се разбърква добре и се центрофугира при 15,928 g, при 4 ° С, в продължение на 5 минути. След центрофугиране се получават 200 μL супернатанта и абсорбцията се измерва с помощта на четец за микроплаки (Infinite ® 2000 PRO; Tecan, Швейцария) при 510 nm.

Статистически анализ

Експериментите са проведени в три екземпляра и данните са изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). Тестовете на Student бяха използвани за единични статистически сравнения. Статистическата значимост беше зададена на (#) = p 1 A). Интересното е, че цветът на всеки екстракт варира въз основа на визуално наблюдение (фиг. 1 Б). Цветът на EtOH екстрактите, 90% или по-високи, беше ясен, докато 50% (v/v) EtOH екстракт изглеждаше най-червеникав. Резултатът от колориметъра разкрива стойност * за зачервяване за 50% EtOH, която показва най-високото ниво сред екстрактите (фиг. 1 С).

екстракция

Екстракция на венчелистчетата на Rosa gallica. Примерна подготовка на екстракти от EtOH от венчелистчета от Rosa gallica (A). Изображения на различни екстракти от EtOH от венчелистчета на Rosa gallica (Б.). Измерването на стойността a * на измервател на цветовата разлика (° С). Данните представляват 3 независими експеримента, които дават подобни резултати. Знакът (**) показва значителен (p 2 A). Освен това, 30% и 50% EtOH екстракти показват по-силни инхибиращи ефекти от аскорбиновата киселина. Аскорбиновата киселина е описана като средство за избелване на кожата в предишна литература (Chang, 2009). За да се оцени активността на избелването на кожата на екстрактите в клетъчен модел, производството на меланин се оценява в B16F10 меланомни клетки след третиране с всеки екстракт. Порция от 100 nM α-MSH увеличава производството на меланин и всеки екстракт от розови листенца инхибира производството на меланин (фиг. 2 Б). Освен това, 30% и 50% EtOH екстракти показват най-силния инхибиторен ефект върху активността на тирозиназата и производството на меланин in vitro, съответно. При подобни условия се изследва ефектът на всеки от екстрактите върху експресията на тирозиназа. Също така, α-MSH повишава експресията на тирозиназа и 100 μg/mL всеки от екстрактите атенюира експресията на тирозиназа (Фиг. 2 С). Лечението с екстракти от 100 μg/ml не е причинило клетъчна цитотоксичност в B16F10 меланомни клетки (фиг. 2 D). По този начин, инхибирането на меланина от RPE се дължи на двойното сливане на активността на тирозиназата и изразява липсата на цитотоксичност.

Предполага се, че тъмночервеният цвят на 50% EtOH разтворител на розови листенца е свързан с антоцианин, флавоноид (фиг. 1). Този резултат обосновава констатациите от предишно проучване (Oancea et al., 2012). Според предишното проучване, антоцианините в боровинките (Vaccinium orymbosum L.) са най-добре извлечени в 50% EtOH разтворител, отколкото във всеки друг разтворител, включително 60%, 70% и 80% EtOH (Oancea et al., 2012). Естествено, антоцианините се срещат като гликозиди. По този начин предположихме, че полярността на антоцианините може да е била предоставена от 50% EtOH разтворител. Силната антиоксидативна активност на антоцианините е добре демонстрирана в различни моделни системи (Kalt et al., 2003; Rice-Evans et al., 1995). Тъй като 50% EtOH екстракт от розови листенца имаше най-високото съдържание на антоцианин, антиоксидантната активност на 50% EtOH екстракт беше най-силна сред екстрактите от 50 μg/ml.

В обобщение, нашето проучване демонстрира потенциала на RPE като съставка против стареене на кожата. С цел промишлено приложение, оптимизирането на условията за добив е от съществено значение, за да се намалят производствените разходи. Настоящото проучване изследва разтворители, най-подходящи за екстракция на венчелистчета от рози, по отношение на активността против стареене на кожата. Флавоноидите в розовите листенца се екстрахират най-добре от 50% EtOH разтворител. Този екстракт показа най-силната антиоксидативна активност, както и активността против стареене на кожата като избелване на кожата и потискане на бръчките. Може да са необходими клинични проучвания и анализи за стабилност, за да се провери неговата пригодност за промишлено приложение.

Благодарности

Това изследване беше подкрепено от Главна изследователска програма (E0183112-02) на Корейския изследователски хранителен институт (KFRI), финансирана от Министерството на науката, ИКТ и бъдещото планиране и от Корейския институт за планиране и оценка на технологиите в храните, земеделието, горите и Рибарство (IPET) чрез Програма за развитие на хранителни технологии с висока добавена стойност, финансирана от Министерството на земеделието, храните и селските райони (MAFRA) (118060-03-2-HD020).

Съответствие с етичните стандарти

Между авторите няма конфликт на интереси.

Бележки под линия

Бележка на издателя

Springer Nature остава неутрален по отношение на юрисдикционните претенции в публикувани карти и институционални принадлежности.