Кристиан Брюкс

институт по биохимия, Университет в Кьолн, Германия

Карстен Нифинд

институт по биохимия, Университет в Кьолн, Германия

Алон Бен-Дейвид

b Департамент по биотехнологии и хранително инженерство и Институт по катализа на науката и технологиите, Технион – Израелски технологичен институт, Хайфа, Израел

Мая Леон

b Департамент по биотехнологии и хранително инженерство и Институт по катализа на науката и технологиите, Технион – Израелски технологичен институт, Хайфа, Израел

Гил Шоъм

c Катедра по неорганична химия и Лаборатория за структурна химия и биология, Еврейският университет в Йерусалим, Йерусалим, Израел

Ювал Шоъм

b Департамент по биотехнологии и хранително инженерство и Институт по катализа на науката и технологиите, Технион – Израелски технологичен институт, Хайфа, Израел

Дитмар Шомбург

институт по биохимия, Университет в Кьолн, Германия

Резюме

β- d-ксилозидазите (EC 3.2.1.37) са хемицелулази, които разцепват единични ксилозни единици от нередуциращия край на ксилоолигомерите. В това проучване е описана кристализацията и предварителният рентгенов анализ на β- d-ксилозидаза от Geobacillus stearothermophilus T-6 (XynB3), семейство 43 гликозид хидролаза. XynB3 е 535-аминокиселинен протеин с изчислено молекулно тегло 61 891 Da. Пречистените рекомбинантни нативни и каталитично неактивни мутантни протеини бяха кристализирани и кокристализирани с ксилобиоза в две различни космически групи, P21212 (параметри на единичните клетки a = 98.32, b = 99.36, c = 258.64 Å) и P41212 (или енантиоморфната космическа група P43212; единица -клетъчни параметри a = b = 140,15, c = 233,11 Å), в зависимост от препарата. Прехвърлянето на кристали в криоусловия изисква много внимателен протокол. Орторомбичните кристали дифрагират до 2,5 Å, а тетрагоналните кристали до 2,2 Å.

1. Въведение

Xylan е най-разпространеният хемицелулозен полизахарид в растителната клетъчна стена, представляващ до 30–35% от общата му суха маса. Този хетерополизахарид е съставен от β-1,4-свързан ксилопиранозилов скелет, заместен с различни групи като α-1 -арабинофуранозил, d-глюкуронопиранозил, 4-О-метил-d-глюкуронопиранозил и ацетилови групи. Пълното разграждане на ксилана е ключова стъпка във въглеродния цикъл в природата и поради неговата структурна сложност изисква синергично действие на няколко хемицелулази (Shallom & Shoham, 2003 ▶; Beg et al., 2001 ▶; Collins et al., 2005 ▶). Сред тези ензими, β-d-ксилозидазите (EC 3.2.1.37) са отговорни за окончателното освобождаване на ксилозни единици от ксилоолигомери, генерирани от ендо-1,4-β-ксиланази (EC 3.2.1.8), които хидролизират гръбначния стълб на ксилана.

Хемицелулазите са главно гликозидни хидролази (EC 3.2.1–3.2.3), широко разпространена група ензими, хидролизиращи гликозидната връзка между два или повече въглехидрати или между въглехидрат и невъглехидратна част (Henrissat et al., 1995 ▶). Хидролизата на гликозидната връзка може да се извърши по един от двата механизма, което води до задържане или обръщане на аномерната конфигурация на субстрата. И двата механизма изискват две карбоксилни киселини. Задържащите гликозидази използват механизъм с двойно изместване, където единият каталитичен остатък функционира като нуклеофил, а другият като обща киселинна основа. Инвертиращите гликозидази използват механизъм с едно изместване, при който една карбоксилна киселина действа като обща киселина, а друга като обща основа (Sinnott, 1990 ▶). В момента са известни повече от 17 000 гликозидазни последователности и базираната на последователността класификация на техните каталитични домейни в семейства и кланове на гликозид хидролаза (GH) е достъпна на непрекъснато актуализирания сървър с въглехидратни активни ензими (CAZY) (http: // afmb. cnrs-mrs.fr/CAZY/). β-ксилозидази се намират в задържащите GH семейства 3, 39, 51, 52 и 54 и в инвертиращото GH семейство 43.

2. Експериментално

2.1. Изразяване и пречистване

Генът xynB3 (присъединителен номер на GenBank> AAT98625) от G. stearothermophilus T-6 е клониран във pET9d вектор (Novagen), свръхекспресиран в Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) и пречистен, както е съобщено по-рано (Shallom et al., 2005 ▶). Накратко, след растеж през нощта в среда на Terrific Broth, културата е събрана, ресуспендирана и нарушена от два пасажа през френска преса. Клетъчният екстракт се центрофугира и разтворимата фракция се обработва термично (333 К, 30 минути) и се центрофугира отново. Рекомбинантният XynB3 в разтворимата фракция беше допълнително пречистен чрез гел филтрация, използвайки Superdex 200 26/60 колона.

2.2. Експерименти с кристализация

Експериментите за кристализация се провеждат при 285 К, като се използва настройката на седнала капка по метода на дифузия на пара в 24-ямкови плаки. Първоначалните условия на кристализация бяха скринирани, използвайки подхода с оскъдна матрица (Jancarik & Kim, 1991 ▶) и бяха допълнително подобрени с помощта на екрани за детергент и добавки Hampton Research. Първоначалните капчици се приготвят чрез смесване на 2 µl протеинов разтвор с 2 µl резервоарен разтвор и се уравновесяват с 300 µl резервоарен разтвор. След подобряване на условията на кристализация, капчицата се състои от 5 µl протеинов разтвор при концентрация 22–30 mg ml −1, 5 µl разтвор на резервоара и 1 µl разтвор на детергент и обемът на резервоара се увеличава до 500 µl. В случай на кокристализация, 0,4 µl разтвор на ксилобиоза при 500 mM се добавя към капчиците.

2.3. Криопротекторни буферни и дифракционни експерименти

За експерименти с рентгенова дифракция при криогенна температура кристалите се прехвърлят в разтвор, съдържащ глицерол като криопротектор. Тази стъпка изглежда много чувствителна, тъй като кристалите се разрушават, ако се прехвърлят директно в буфера за криопротектор. За да се предотврати такова нарушаване, концентрацията на криопротекторите се увеличава постепенно. След като разтворът съдържа 17% (v/v) глицерол, кристалите се монтират върху найлонова верига и се охлаждат бързо в течен азот. Суровите дифракционни данни бяха индексирани, интегрирани и мащабирани с DENZO и SCALEPACK от HKL suite (Otwinowski & Minor, 1997 ▶).

2.4. Изчисляване на молекулярно заместване

Изчисленията за самообръщане бяха извършени с програмата GLRF (Tong & Rossmann, 1997 ▶). За кръстосано въртене и търсене на превод са използвани програмите MOLREP и AMoRe от набора CCP4 (Collaborative Computational Project, номер 4, 1994 ▶).

3. Резултати и дискусия

3.1. Кристализация и кристална оптимизация

кристализация

Снимки на кристали на XynB3 (а), отгледани в примитивна орторомбична кристална форма с детергент DDAO и (б) отгледани в примитивна тетрагонална кристална форма с детергент HEGA-8 под поляризирана светлина.

3.2. Протокол за криоконсервация

Крайният разтвор за криозащита се състои от 17% (v/v) глицерол, 19% (w/v) PEG 6000, 0.1 M MES pH 5.4 и, както бе споменато по-горе, прехвърлянето на кристалите в криопротектор трябваше да се извърши в много малки стъпки. Ако концентрацията на криопротектор се увеличи твърде бързо, и двата вида кристали се разрушават незабавно и не могат да бъдат използвани за по-нататъшни дифракционни експерименти. За да се постигнат задоволителни криоусловия, трябва да се приложи модифициран протокол (Garman & Doublié, 2003 ▶). Малки количества разтвор (2–5 µl), съдържащ глицерол като криопротектор, се добавят към кристалната капка и след това кристалите се оставят да се уравновесят в продължение на поне 2 часа преди да се добави нов разтвор, съдържащ по-висока концентрация на глицерол. За да се поддържа обемът на капчицата постоянен, същият обем, който беше добавен към капчицата, беше премахнат малко преди това. Модифицираният протокол, използван за кристалите XynB3, се провежда в продължение на 4 дни до достигане на крайните криоусловия. Заместването на глицерол като криопротектор с PEG, MPD, парафиново масло или глюкоза не подобрява криопротокола.

3.3. Събиране и обработка на данни

Данните за дифракция от кристали, отгледани с DDAO, бяха събрани на лъчева линия BL1 на фабриката за протеинова структура (PSF) в Berliner Elektronenspeicherring Gesellschaft für Synchrotronstrahlung (BESSY, Берлин). Най-добрите данни бяха измерени с разделителна способност 2,5 Å (Таблица 1 ▶). Дифракционният модел показва орторомбична единична клетка с параметри на единичната клетка a = 98,318, b = 99,358, c = 258,642 Å. Предишни биохимични характеристики, извършени с помощта на гел филтрация, показват, че XynB3 е тример в разтвор. Въпреки това, най-вероятната стойност на V M (коефициент на Матюс) е 2,5 Å 3 Da -1, приемайки наличието на четири ксилозидазни мономера в асиметричната единица (246,5 kDa; 51,4% съдържание на разтворител; Matthews, 1968 ▶). Функцията за самообръщане на тази кристална форма е в съответствие с тетрамерна кватернерна структура на ензима с 222 точкова симетрия (фиг. 2 ▶ а). В допълнение към очакваните кристалографски пикове, самовъртането показва осем некристалографски пика в селекцията κ = 180 °. Два от тези върхове принадлежат на 222 система от три двойни оси, перпендикулярни една на друга. Третата двойна ос на всяка 222 система е успоредна на кристалографската ос c. Не могат да се наблюдават оси на въртене на 120 °, които да показват тримерна кватернерна структура.

(а) Функция за самообръщане за орторомбичната космическа група, κ = 180 ° сечение. (b) Функция за самообръщане за тетрагоналната космическа група, κ = 180 ° сечение.

маса 1

Стойностите в скобите са за външната обвивка.

Кристална форма Орторомбична (детергент DDAO) Тетрагонална (детергент HEGA-8)
СинхротронBL1, PSF, BESSY, БерлинX13, EMBL Outstation, Хамбург
Дължина на вълната (Å)0,97970,8048
Параметри на единични клетки
a (Å)98,32140.15
b (Å)99,36140.15
c (Å)258,64233.11
Космическа групаP21212P41212 (или P43212)
№ мономери в AU44
VM (Å 3 Da -1)2.52.3
Ъгъл на трептене на кадър (°)0,30,1
Брой рамки823772
Температура за събиране на данни (K)100100
Резолюция (Å)2,5 (2,54–2,50)2,2 (2,23–2,20)
Мозайка (°)0,360,41
Общ брой отражения30447315966877
Брой отхвърлени отражения96005096
Брой уникални отражения88547116620
Пълнота (%)99,9 (99,1)99,5 (97,8)
Rmerge (%)6,6 (12,4)7,1 (19,6)
〈I/σ (I)〉 22,7 (12,3)12,0 (6,5)

Данните от втората кристална форма, отгледана с детергент HEGA-8, бяха събрани на лъчева линия X13 в EMBL Outstation, Хамбург (Таблица 1 ▶). Събран е пълен набор от данни с разделителна способност 2.2 Å. Данните могат да бъдат индексирани в примитивната тетрагонална пространствена група P41212 (или P43212), с параметри на единичната клетка a = b = 140.15, c = 233.11 Å. Изчисляването на коефициента на Матю предполага, че в асиметричната единица има четири мономера с V M от 2,3 Å 3 Da -1 и съдържание на разтворител от 46,4%. Както в орторомбичната пространствена група, функцията за самообръщане е в съответствие с тетрамерна кватернерна структура (фиг. 2 ▶ b). В този случай некристалографски 422 системи също се виждат с една от трите двойни оси, успоредни на кристалографската ос c.

3.4. Структурно решение

Структурата на XynB3 беше решена с помощта на техники за молекулно заместване, като структурата на семейство 43 β- d-ксилозидаза от Bacillus subtilis (PDB код 1yif; Patskovsky & Almo, 2005 ▶) като модел за търсене. Този протеин споделя сходство на последователността от 65% с XynB3. Използвайки програмите MOLREP и AMoRe от програмния пакет CCP4 (Collaborative Computational Project, Number 4, 1994 ▶), могат да бъдат намерени значителни върхове във функцията на въртене и транслация, което е довело до правдоподобна опаковка на кристали за всяка от двете кристални форми. В момента се извършва пълен анализ на структурата.

Благодарности

Това проучване беше подкрепено с безвъзмездни средства от GIF (Германско-израелската фондация за научни изследвания и развитие; за YS, DS и GS) и от Израелската научна фондация (за GS и YS). Допълнителна подкрепа беше предоставена от Центъра за биотехнологии на Otto Meyerhof Minerva, Technion, създаден от Фондация Minerva (Мюнхен, Германия).