1 Интерстициално отделение за белодробни заболявания, Университетска болница в Ираклион, 71110 Ираклион, Крит, Гърция

самояден

2 Лаборатория по вирусология, Медицинско училище, Университет на Крит, 71110 Ираклион, Крит, Гърция

Резюме

Идиопатичната белодробна фиброза е най-честата и тежка форма на идиопатична интерстициална пневмония. Въпреки експоненциалното увеличаване на нашето разбиране за потенциално важни медиатори и механизми, патогенезата остава неуловима и през последните няколко години е постигнат малък терапевтичен напредък. Смъртността след 3-5 години все още е 50%. Автофагията, силно запазен хомеостатичен механизъм, необходим за оцеляването на клетките, напоследък е замесена в патогенезата на белодробните разстройства. В настоящата статия се стремим да подчертаем някои ключови въпроси относно процеса на автофагия и възможната му връзка с патогенезата на идиопатичната белодробна фиброза.

1. Въведение

Идиопатичната белодробна фиброза (IPF) е хронична и прогресираща фиброзираща интерстициална пневмония с неизвестна причина, чиято патогенеза, въпреки последните постижения, все още не е напълно изяснена [1]. Понастоящем се смята, че IPF е резултат от повтарящи се наранявания в различни места на алвеоларния епител с нарушена регулация на клетъчната хомеостаза, последвано от анормално зарастване на рани и неадекватно възстановяване на епителните увреждания. Средната преживяемост от момента на поставяне на диагнозата е приблизително 3 години и изненадващо смъртността надвишава тази при много видове рак [2]. Белодробната трансплантация е единственият терапевтичен подход, който може да повлияе на оцеляването, но е ограничен до силно подбрани пациенти. Въпреки това, последните клинични проучвания дадоха обнадеждаващи резултати по отношение на употребата на пирфенидон и N-ацетил-цистеин при леко до умерено заболяване [3, 4].

Предвид ограничените съвременни познания и лошото оцеляване на болестта, необходимостта от изясняване на патогенезата става наложителна. Напоследък процесът на автофагия, термин, получен от гръцки и означаващ „самоядство“, е замесен в патогенетичния път на IPF [5, 6]. Автофагията е силно запазен хомеостатичен механизъм, чрез който клетките транспортират увредени протеини и органели като митохондрии до лизозоми за разграждане както в здравословно състояние, така и при болестни състояния. Той допринася за клетъчната хомеостаза, като (а) осигурява алтернативен източник на метаболитно гориво, (б) премахва увредените клетъчни компоненти, които са токсични за клетката като дисфункционални митохондрии или агрегирани протеини, и (в) насърчава клетъчната смърт [7].

В предишни проучвания е въведен терминът селективна автофагия, за да се подчертае селективното насочване на товари за деградация. Митофагията се отнася до селективно смилане на митохондриите, а ксенофагията се отнася до селективно разграждане на нахлуващи патогени и бактерии [8, 9]. Селективното разграждане на протеиновите агрегати се регулира от р62, цитозолен шаперонов протеин.

Повечето от настоящите знания относно ролята на автофагията в клетъчната хомеостаза са получени чрез проучвания върху дрожди и мишки, докато нейната роля при човешките болести е само малко проучена и изглежда силно плейотропна, тъй като може да представлява възприемащ отговор за пробуждане или, ако са дерегулирани, насърчават клетъчната смърт и заболеваемост. Автофагичната клетъчна смърт се различава от апоптотичната клетъчна смърт; първият не включва активиране на каспаза. Независимо от това двата процеса могат да съществуват едновременно [10].

В настоящата статия имаме за цел да подчертаем съвременните познания относно процеса на автофагия и неговата роля при различни белодробни нарушения с особен фокус върху IPF.

2. Класове и регулиране на автофагията

Има три механизма, чрез които може да възникне автофагия. Микроавтофагията включва неселективно заобикаляне на цитоплазмените компоненти директно от лизозомни мембрани. Аутофагията, медиирана от шаперон, включва селективен транспорт до лизозоми на товари, които съдържат специфичен пентапептиден мотив (KFERQ). Макроавтофагията се характеризира с наличието на автофагозома, двумембранна везикула, която заобикаля увредения компонент и се разгражда след сливане с ендозоми и лизозоми. Чаперон-медиираната автофагия и микроавтофагията са по-малко изучени, докато макроавтофагията (наричана по-нататък автофагия) е най-добре проученият механизъм, тъй като автофагозомите са лесни за откриване с флуоресценция и електронна микроскопия [11]. Процесът се състои от четири отделни етапа: (а) образуване на изолираща мембрана, (б) образуване на автофагозома с поглъщане на товара, (в) сливане на автофагозомата с лизозома и (г) разграждане на товара от лизозомни ензими с регенериране на метаболитни молекули-предшественици, които да се използват за анаболни пътища [7].

Поредица от свързани с автофагията гени (Atg) участват в регулирането на процеса. Beclin-1, взаимодействащ протеин, в комплекс с фосфатидилинозитол 3-киназа от клас III (PI3 K) и Atg14 действа като основен положителен регулатор на автофагията [12]. Чувствителната към рапамицин бозайник мишена на рапамицин (mTOR)/клас I PI3 K пътека действа като основен отрицателен регулатор на автофагията [13, 14]. Образуването на автофагозома изисква две конюгационни системи, подобни на убиквитин: системата за конюгация Atg5 – Atg12 и системата за конюгация Atg8 (свързана с микротубули протеин-1 лека верига [LC] (3), чрез която LC3 се преобразува от LC3-I (свободна форма) в LC3 II (конюгиран с фосфадитилетаноламин форма) стъпка, която се счита за критична за образуването на автофагозома [15-17]. Сливането на автофагозома с лизозома изисква участието на GTPase, наречена Rab-7, и лизозомно-медииран мембранен протеин (LAMP) -1 и -2.

3. Автофагия при белодробни заболявания

Кистозната фиброза (CF) е заболяване, характеризиращо се с мутации на гена на трансмембранната регулаторна проводимост (CFTR) на муковисцидозата, което е свързано с вътреклетъчно натрупване на неправилно сгънати протеини, за които се предполага, че се изчистват чрез автофагия. Забелязано е, че в CF човешки епителни клетки мутантните CFTR протеини увреждат образуването на автофагозома чрез изчерпване на Beclin-1 [30] и увеличаване на производството на реактивни кислородни форми (ROS) и трансглутаминаза-2, което допринася за прекомерното възпаление, наблюдавано при CF. Възстановяването на Beclin-1 възстановява автофагията, измерена чрез нива на LCEb-II и p62 и GFP-LC3 пункта и води до повишен клирънс на протеинови агрегати и значително намаляване на възпалението при миши модел на CF [30]. Интересното е, че лечението с N-ацетилцистеин (NAC) също има благоприятни ефекти, което предполага възможно въздействие на антиоксидантите в терапията на CF. Инфекция от Burkholderia cenocepacia е потенциално смъртоносна при пациенти с МВ и е забелязано, че е свързана с понижаване на регулацията на няколко автофагични гена в алвеоларните макрофаги [31]. Лечение с индуцирана от рапамицин автофагия и намалено възпаление на белите дробове.

Алвеоларните макрофаги осигуряват първата линия на защита срещу нахлуващи микроби. Инфекция от Mycobacterium tuberculosis също е свързано с инхибиране на образуването на автофагозоми, което инхибира микобактериалното убиване от алвеоларни макрофаги [32]. Стимулиране на алвеоларни макрофаги с интерферон-γ (IFN-γ) повишава регулирането на GTPase, а именно IRGM-1, и активира автофагията [33]. Индукцията на автофагия от рапамицин също подобрява убиването на микобактериите [34].

Изглежда, че автофагията е замесена в развитието на белодробна хипертония (PH). В белодробни проби от човешко PH и белодробна васкулатура се наблюдава повишена експресия на LC3b и GFP-LC3 puncta образуване, маркер на автофагозомното образуване в GFP-LC3-трансфектирани ендотелни клетки. Когато мишките с генетичен дефицит на LC3b са били изложени на хронична хипоксия, те демонстрират доказателства за повишена белодробна хипертония в сравнение с мишки от див тип, предполагащи защитна роля на автофагия чрез ограничаване на пролиферацията на съдовите клетъчно зависими от хипоксия [35].

Комплексът на туберозната склероза (TSC) е автозомно доминиращ туморен супресорен ген, причинен от мутации на зародишна линия в гените TSC1 или TSC2. Пациентите с TSC имат мултисистемни прояви като неврологично заболяване, доброкачествени тумори в множество органи и белодробна лимфангиолейомиоматоза (LAM). Генетичното и фармакологично инхибиране на автофагията блокира туморогенезата при ксенографт и спонтанни модели на TSC [36] и следователно може да представлява потенциална терапевтична цел за TSC.

Автофагията има функционални последици в патогенезата на рака, но са проведени само няколко проучвания, специално при рак на белия дроб, и е оценена ролята на автофагията в отговор на химиотерапевтични агенти, използващи култивирани човешки белодробни клетки A549 аденокарцином [37, 38]. Интересното е, че Нелфинавир, ХИВ протеазен инхибитор, упражнява плейотропни биохимични и клетъчни ефекти, които включват индукция на ендоплазмен ретикулум (ER) стрес, автофагия и апоптоза инвитро и in vivo и проявява антипролиферативна активност в белодробни ракови клетки [39].

4. Автофагия и IPF: Косвени патогенетични връзки

Все повече доказателства предполагат, че може да има патогенетична връзка между IPF и автофагията. Оксидативният стрес, стресът от ендоплазмен ретикулум (ER) и хипоксията, всички механизми, които участват в патогенезата на IPF [40–42], са добре известни индуктори на автофагия [43–45]. От друга страна, вирусните инфекции, за които също се предполага, че благоприятстват развитието на фиброза, изглежда имат инхибиторен ефект върху автофагията.

ER е органела, която изпълнява общи функции като улесняване на сгъването на протеини и транспортирането на новосинтезирани протеини. Оксидативният стрес, нарушения в регулацията на калция, лишаване от глюкоза и вирусна инфекция могат да причинят ER стрес, който води до увеличаване на разгънатите протеини [46]. В клетките на невробластома ER стресът предизвиква автофагия и е свързан с оцеляването на клетките [47]. Въпреки това, ER-индуцираната автофагия може да бъде специфична за клетките, тъй като се видя, че при клетъчните линии на рака на дебелото черво и простатата активирането на автофагия от химични индуктори намалява клетъчната смърт, докато в нормалните човешки клетки на дебелото черво и в нетрансформираните ембрионални фибробласти допринася за клетъчната смърт [48]. В белодробните епителни фибробластни клетъчни линии, автофагията, индуцирана от химикали, води до повишено натрупване на LC3-II и активиране на разгънат протеинов отговор, компенсаторен механизъм на ER стрес [49], предполагащ възможна защитна роля на автофагията.

Понастоящем се приема, че IPF е резултат от множество наранявания в епитела, което води до ранна смърт на алвеоларните епителни клетки от тип II (AECs II) и аберантно заздравяване на рани. В случаите на фамилна IPF беше показано, че мутациите на гена на повърхностноактивния протеин-С (SFTRC) водят до натрупване на неправилно сгънати протеини, индукция на ER стрес и апоптоза на AEC II [50-53]. При спорадични IPF и независимо от отсъствието на мутации, също се наблюдава увеличение на ER стрес и апоптотични маркери в AEC II [54]. Наскоро беше забелязано също така, че ER стресът е замесен в диференциацията на фибробласт в миофибробласт, което се счита за ключово събитие в патогенезата на IPF [40].

ROS и маркерите на оксидативен стрес са очевидни при IPF, а нивата на ROS са в отрицателна корелация с белодробната функция [58–60]. Свръхпроизводството на ROS може да причини увреждане на белите дробове и да насърчи тъканната микросреда, която благоприятства фиброзата пред регенерацията. Установено е, че глутатионът, антиоксидант, намалява в IPF [61]. NAC е способен да стимулира синтеза на глутатион, като увеличава вътре- и извънклетъчните нива и по този начин частично възстановява нивата на глутатион [62, 63]. Установено е, че NAC има благоприятни ефекти върху белодробната функция на пациенти с IPF и главно при тези с по-слабо прогресиращо заболяване [4, 64]. Резултатите от скорошно проучване обаче показаха противоречиви резултати, които се нуждаят от допълнително внимателно проучване [65].

Автофагията е чувствителна към напрежението на кислорода и индуцирания от хипоксия фактор 1-α (HIF 1-α) е замесен като регулатор на автофагията и на оборота на увредени митохондрии при хипоксично състояние. HIF 1-α целевият ген, а именно Bcl-2/аденовирус E1B 19 kDa — взаимодействащ протеин-3 (BNIP3), също регулира индуцираната от хипоксия автофагия [45, 66]. Въпреки това, дори и в случай на хипоксия, се очертава двойствената роля на автофагията, както в друго проучване се наблюдава, че продължителната хипоксия предизвиква автофагична клетъчна смърт чрез механизъм, зависим от BNIP3 [67].

Сега се смята, че хипоксията може да доведе до апоптоза на алвеоларните епителни клетки, инициираща каскадата на фиброгенезата. В действителност, както при животински модели на индуцирана от блеомицин фиброза, така и в белодробни тъкани на пациенти с IPF, HIF 1-α е свръхекспресиран и може да упражнява ролята си в ранните етапи на фиброгенезата, тъй като е локализиран в зони с активна фиброза и в нормални зони на белия дроб IPF, но не и във фибробластните огнища, които представляват зони на установена фиброза [42].

5. Автофагия в IPF

Наскоро Mi et al. са показали, че IL17A, цитокин, който индуцира производството на колаген и насърчава епително-мезенхимния преход (ЕМТ) чрез трансформиращ растежен фактор-β1- (TGF-β1-) зависим механизъм, инхибира автофагията в миши епителни клетки [80]. Освен това те наблюдават, че в миши модел на BLM-индуцирана фиброза, антагонизмът на IL17A активирана автофагия, намалява производството на колаген, атенюира фиброзата и увеличава оцеляването. Този защитен ефект е премахнат след блокиране на автофагията с 3-метиладенин (3-МА).

Patel и сътр. изследва маркери на автофагична активност и заключава, че автофагията не се индуцира в белите дробове на човешкия IPF [5]. По-подробно те наблюдават, че нивата на LC3-II са по-ниски и нивата на p62 са по-високи в белите дробове на IPF в сравнение с контролите. Освен това те наблюдават намаляване на броя на автофагозомите с електронен микроскоп в белите дробове на IPF. За да дадат правдоподобен отговор, те използвали фибробластни клетъчни линии и показали, че TGF-β1, профибротичният цитокин, който е свръхекспресиран в IPF, инхибира автофагията. Заглушаването на гените LC3 и beclin-1 и, следователно, инхибирането на автофагията подобрява експресията на фибронектин и α-гладкоклетъчен актин, маркер на миофибробласт, който е ключова клетка в процеса на фиброгенеза. В BLM модела те наблюдават, че лечението с рапамицин засилва автофагията и предпазва от фиброза. Въз основа на тези наблюдения авторите заключават, че автофагията предпазва от развитието на фиброза.

Нарастващият брой доказателства както на клинично, така и на биологично ниво предполага, че IPF е заболяване на стареенето, характеризиращо се с преждевременни промени, свързани с възрастта в алвеоларните епителни клетки [81]. Прието е също така, че автофагията функционира по-малко с напредване на възрастта на тъканите поради недостатъчно образуване на автофагозоми или недостатъчно елиминиране след сливане с лизозоми [82]. Наскоро Araya et al. също се опита да изясни ролята на автофагията в IPF [6]. Те предположиха, че недостатъчната автофагия води до стареене на епителните клетки, тъй като те наблюдават повишена експресия на p62 и убиквитинирани протеини, и двата маркера за намалена автофагия, както и повишена експресия на p21, който е маркер на клетъчното стареене. От друга страна и в съгласие с предишни наблюдения на специфичния за клетките ефект на автофагията, те показаха, че недостатъчната автофагия в белодробните фибробласти води до диференциация към миофибробластите без никакъв ефект върху тяхното стареене и до повишено производство на извънклетъчен матрикс, които са критични стъпки фиброгенетичният процес.

6. Заключение

През последното десетилетие имаше взрив в областта на изследванията относно възможните механизми, участващи в патогенезата на IPF и клиничните изпитвания, за да се намери терапевтичен агент, способен поне да стабилизира хода на заболяването. Въпреки всички тези усилия, патогенезата на IPF все още не е напълно изяснена. Все още не е открит общоприет терапевтичен агент. Напоследък се предполага, че трябва да има „онкологичен“ подход в патогенезата на IPF. Според тази хипотеза, множество пътища могат да бъдат включени едновременно в патогенезата на IPF и бъдещите терапевтични подходи трябва да насочват тези пътища едновременно [83]. Освен това тази хипотеза е подсилена от наблюдението, че има известни прилики между IPF и биологията на рака на белия дроб [2]. Наскоро автофагията е замесена в патогенезата на белодробните заболявания и в областта на IPF съществуват само няколко проучвания, поради което нейната роля е доста неясна. Следователно са необходими повече проучвания, за да се изясни ролята на автофагията в IPF и за да се разработят нови терапевтични подходи.

Препратки